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hxm007199

铁虫 (初入文坛)

[求助] 荧光PCR探针特异性不足如何优化?

阴性阳性DNA模板的上游下游引物都是一样的,但是探针中间有两个连续的碱基不同
理论上,探针有一个不同就没有信号了
但是,实际结果是:阳性模板CT值为23,阴性模板CT值28(二步法,60度退火延伸)
然后我又把退火温度提高到61度和62度,结果阳性CT值不变,阴性模板CT值29,30

请问一下,有什么优化方法可以提高特异性,让阴性模板没有扩增曲线?
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生可忍,熟不可忍!
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love_st

金虫 (著名写手)


【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-09-28 13:21:46
很难区分的了,不知道你探针多长,你在中间不同,也许在5‘端就已经有信号了,或许挪下位置试试
2楼2013-09-28 11:31:59
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-09-28 20:37:03
重新设计引物,让引物的3‘端同阴性模板不匹配(一两个碱基就行)。试试竞争PCR(估计效果不能太好)
3楼2013-09-28 16:19:10
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hxm007199

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2013-09-28 11:31:59
很难区分的了,不知道你探针多长,你在中间不同,也许在5‘端就已经有信号了,或许挪下位置试试

探针24个碱基
现在的情况是,引物探针没有挪动的余地,希望通过改变条件,来抑制非特异扩增
生可忍,熟不可忍!
4楼2013-09-30 14:10:34
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love_st

金虫 (著名写手)


【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by hxm007199 at 2013-09-30 14:10:34
探针24个碱基
现在的情况是,引物探针没有挪动的余地,希望通过改变条件,来抑制非特异扩增...

那就探针往后挪点位置,尽量把突变的点在前面
5楼2013-09-30 15:30:52
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