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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光PCR探针特异性不足如何优化？
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hxm007199

铁虫 (初入文坛)

[求助] 荧光PCR探针特异性不足如何优化？

阴性阳性DNA模板的上游下游引物都是一样的，但是探针中间有两个连续的碱基不同
理论上，探针有一个不同就没有信号了
但是，实际结果是：阳性模板CT值为23，阴性模板CT值28（二步法，60度退火延伸）
然后我又把退火温度提高到61度和62度，结果阳性CT值不变，阴性模板CT值29,30

请问一下，有什么优化方法可以提高特异性，让阴性模板没有扩增曲线？
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生可忍，熟不可忍！
1楼 2013-09-27 16:41:39
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-09-28 13:21:46
很难区分的了，不知道你探针多长，你在中间不同，也许在5‘端就已经有信号了，或许挪下位置试试
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2楼2013-09-28 11:31:59
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 20:37:03
重新设计引物，让引物的3‘端同阴性模板不匹配（一两个碱基就行）。试试竞争PCR（估计效果不能太好）
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3楼2013-09-28 16:19:10
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hxm007199

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2013-09-28 11:31:59
很难区分的了，不知道你探针多长，你在中间不同，也许在5‘端就已经有信号了，或许挪下位置试试

探针24个碱基
现在的情况是，引物探针没有挪动的余地，希望通过改变条件，来抑制非特异扩增
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生可忍，熟不可忍！
4楼2013-09-30 14:10:34
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by hxm007199 at 2013-09-30 14:10:34
探针24个碱基
现在的情况是，引物探针没有挪动的余地，希望通过改变条件，来抑制非特异扩增...

那就探针往后挪点位置，尽量把突变的点在前面
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5楼2013-09-30 15:30:52
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