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862202686

铁虫 (初入文坛)

[求助] 新手做原核表达 求帮忙

老师让我做效应蛋白原核表达,只是给了我一个蛋白序列的登陆号,其他自己摸索。 在看文献问百度之后,了解了效应蛋白,明白了原核表达的基本步骤。梳理一下:
1.提RNA。(因为是真菌,有内含子,只能反转录。)
2.设计引物。
3.反转录PCR。
4.连接T载体,转入感受态,挑阳性克隆送去测序,验证所得序列是否正确。
5.假设序列正确,提质粒,酶切,连接表达载体,转入表达菌。
不知道这样的步骤有哪些地方有错误或者不合理,希望大家给予指正,万分感谢。
还有,我现在想要设计引物,因为老师只给了一个蛋白序列的登录号,我水平有限,在NCBI上只能获得该氨基酸序列对应的cDNA序列,并不能获得完整的cDNA序列,因为没有两端的序列,我就不能设计引物,求帮助!
我是新虫,只有21个金币,真心感谢大神们的帮助指导!
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chenyuqin

新虫 (小有名气)

可以拿ORF设计;或者用BLAST分析一下找对应基因然后设计
where there is a will,there ia a way.
3楼2013-09-25 22:26:22
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淘淘279

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香分子生物期待你的精彩 2013-09-26 00:04:43
内含子个数不多的话也可以提基因组,把蛋白对应的这段基因通过pcr拿下来,再设计引物把内含子p掉。

[ 发自小木虫客户端 ]
你能做的永远不止这些!
2楼2013-09-25 22:24:58
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862202686

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 淘淘279 at 2013-09-25 22:24:58
内含子个数不多的话也可以提基因组,把蛋白对应的这段基因通过pcr拿下来,再设计引物把内含子p掉。

非常感谢您,但是这样做可能会比较麻烦啊
4楼2013-09-26 09:43:07
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lvshilu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-26 10:04:46
“在NCBI上只能获得该氨基酸序列对应的cDNA序列,并不能获得完整的cDNA序列”
这句话什么意思呢,质粒的插入片段只需要ORF就行了啊,难道还要UTR?
Forward primer:ATG+后面的一些序列
Reversed primer:oligo dT
需要金币
5楼2013-09-26 10:02:39
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