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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 新手做原核表达 求帮忙
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862202686

铁虫 (初入文坛)

[求助] 新手做原核表达 求帮忙

老师让我做效应蛋白原核表达，只是给了我一个蛋白序列的登陆号，其他自己摸索。 在看文献问百度之后，了解了效应蛋白，明白了原核表达的基本步骤。梳理一下：
1.提RNA。（因为是真菌，有内含子，只能反转录。）
2.设计引物。
3.反转录PCR。
4.连接T载体，转入感受态，挑阳性克隆送去测序，验证所得序列是否正确。
5.假设序列正确，提质粒，酶切，连接表达载体，转入表达菌。
不知道这样的步骤有哪些地方有错误或者不合理，希望大家给予指正，万分感谢。
还有，我现在想要设计引物，因为老师只给了一个蛋白序列的登录号，我水平有限，在NCBI上只能获得该氨基酸序列对应的cDNA序列，并不能获得完整的cDNA序列，因为没有两端的序列，我就不能设计引物，求帮助！
我是新虫，只有21个金币，真心感谢大神们的帮助指导！
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1楼 2013-09-25 21:51:35
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lvshilu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不好意思啊，我已经上班了，还是比较忙啊。很多问题我只能有个思路，要是代为执行的话恐怕太耗精力。我可以帮你分析你的问题。
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11楼2013-09-26 11:43:25
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淘淘279

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香分子生物期待你的精彩 2013-09-26 00:04:43
内含子个数不多的话也可以提基因组，把蛋白对应的这段基因通过pcr拿下来，再设计引物把内含子p掉。

[ 发自小木虫客户端 ]
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你能做的永远不止这些！
2楼2013-09-25 22:24:58
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chenyuqin

新虫 (小有名气)
可以拿ORF设计；或者用BLAST分析一下找对应基因然后设计
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where there is a will,there ia a way.
3楼2013-09-25 22:26:22
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862202686

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 淘淘279 at 2013-09-25 22:24:58
内含子个数不多的话也可以提基因组，把蛋白对应的这段基因通过pcr拿下来，再设计引物把内含子p掉。

非常感谢您，但是这样做可能会比较麻烦啊
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4楼2013-09-26 09:43:07
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lvshilu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-26 10:04:46
“在NCBI上只能获得该氨基酸序列对应的cDNA序列，并不能获得完整的cDNA序列”
这句话什么意思呢，质粒的插入片段只需要ORF就行了啊，难道还要UTR？
Forward primer：ATG+后面的一些序列
Reversed primer：oligo dT
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5楼2013-09-26 10:02:39
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862202686

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenyuqin at 2013-09-25 22:26:22
可以拿ORF设计；或者用BLAST分析一下找对应基因然后设计

ORF怎么设计 求指导
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6楼2013-09-26 10:11:17
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862202686

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lvshilu at 2013-09-26 10:02:39
“在NCBI上只能获得该氨基酸序列对应的cDNA序列，并不能获得完整的cDNA序列”
这句话什么意思呢，质粒的插入片段只需要ORF就行了啊，难道还要UTR？
Forward primer：ATG+后面的一些序列
Reversed primer：oligo  ...

oligo dT 是什么东西 求详细介绍 多谢
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7楼2013-09-26 10:13:32
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lvshilu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

oligo dT就是一条引物全是TTTTTT...,是跟mRNA的polyA配对的啊，反转录必须用的啊
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8楼2013-09-26 10:17:16
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862202686

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lvshilu at 2013-09-26 10:17:16
oligo dT就是一条引物全是TTTTTT...,是跟mRNA的polyA配对的啊，反转录必须用的啊

在终止密码子后面的？
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9楼2013-09-26 10:23:16
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862202686

铁虫 (初入文坛)
内容已删除
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10楼2013-09-26 10:26:45
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