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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 初学双向电泳图谱求助
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zhangbaocau

新虫 (小有名气)

[求助] 初学双向电泳图谱求助

图为真菌胞内蛋白双向电泳图，pH3-10 7cm 胶条，操作和等点聚焦条件等按bio-rad公司说的来得，等电聚焦程序设置
7cm胶条
水化                50V                        12-16小时（20℃）                        主动水化
S1                250V                线性                30分钟                                除盐
S2                500V                快速                30分钟                                除盐
S3                4000V                线性                3小时                                升压
S4                4000V                快速                20,000伏小时                聚焦
S5                500V                快速                任意时间                        保持
        选择所放置的胶条数。
        设置每根胶条的极限电流。（30-50mA/根）
        设置等电聚焦时的温度。（20℃）
SDS电泳，70V，10min,150v,2h.
图谱不好，求高手指点，谢谢！
初学双向电泳图谱求助
IMG_6548.jpg
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1楼 2013-09-07 16:51:46
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-11 11:47:17
产生这个的问题是第一向没有分开。蛋白聚焦不够所以2D的时候看到这样的图谱。建议你增加电压，至少8000v，延长时间。这样，在一维上蛋白聚焦足够好以后，才能在二维上看到点状的，而不是带状的图谱。
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Let'sdoit.
2楼2013-09-08 00:18:15
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zhangbaocau

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yimingwang at 2013-09-08 00:18:15
产生这个的问题是第一向没有分开。蛋白聚焦不够所以2D的时候看到这样的图谱。建议你增加电压，至少8000v，延长时间。这样，在一维上蛋白聚焦足够好以后，才能在二维上看到点状的，而不是带状的图谱。

等点聚焦条件等按bio-rad公司说的来得，他写7cm胶条
不是4000v吗？？？要8000v啊？？我一直以为是样品制备的原因？？
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3楼2013-09-08 22:12:16
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangbaocau(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2013-09-11 11:47:30
显然横纹众多，应该是聚焦不完全。
一般的和普遍的原因与对策：
1.样品没有完全溶解，上样前确保样品完全溶解并且保持稳定。
2.样品中存在干扰IEF的物质存在，改进样品制备方法，可用分子筛、超滤、透析等纯化蛋白质样品。
3.样品中可能存在干扰IEF的离子。可用超滤、透析等纯化蛋白质样品降低离子强度（离子浓度要小于10mmol/L)；或者用TCA、丙酮沉淀蛋白质，然后用缓冲溶液重新溶解被沉淀的蛋白质（当然弃去TCA、丙酮）。
4.做等电聚焦时离子型去垢剂太多时也会出现横纹，将样品用超滤、透析去掉离子型去垢剂，改用离子型去垢剂替代之。
5.聚焦时间过短使得聚焦不完全。需要适当延长聚焦时间。
6.聚焦时间过长，引起胶内渗水，并且改变了凝胶的内部的电场微环境，使得蛋白质样品再次发生移动，导致横纹。电泳时间不能过长。
7.楼主实验用的水是不是也有问题。应该用超纯水。

上样量应该还可以。

具体可以再讨论。
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4楼2013-09-08 23:36:41
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zhangbaocau

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-08 23:36:41
显然横纹众多，应该是聚焦不完全。
一般的和普遍的原因与对策：
1.样品没有完全溶解，上样前确保样品完全溶解并且保持稳定。
2.样品中存在干扰IEF的物质存在，改进样品制备方法，可用分子筛、超滤、透析等纯化蛋 ...

我用的是TCA-丙酮法提取的，样品制备还用超滤啊，这么麻烦啊？？水应该没问题，是分子用的dd水
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5楼2013-09-10 22:17:30
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

超滤失去除杂离子的，不光是浓缩。
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6楼2013-09-11 09:15:36
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

超滤是去除离子和小分子的，不光是浓缩。
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7楼2013-09-11 09:24:36
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学术茹

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-11 09:24:36
超滤是去除离子和小分子的，不光是浓缩。

为双向电泳准备的蛋白样品，看文献介绍都要求透析后冻干 ，这个冻干是为什么呢
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8楼2013-09-11 16:28:42
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
冻干一般是为了保存方便，有时也可以对于纯化有些帮助。
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9楼2013-09-11 20:58:09
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