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zhangbaocau新虫 (小有名气)
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[求助]
初学双向电泳图谱求助
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图为真菌胞内蛋白双向电泳图，pH3-10 7cm 胶条，操作和等点聚焦条件等按bio-rad公司说的来得，等电聚焦程序设置 7cm胶条 水化 50V 12-16小时（20℃） 主动水化 S1 250V 线性 30分钟 除盐 S2 500V 快速 30分钟 除盐 S3 4000V 线性 3小时 升压 S4 4000V 快速 20,000伏小时 聚焦 S5 500V 快速 任意时间 保持 选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。（30-50mA/根） 设置等电聚焦时的温度。（20℃） SDS电泳，70V，10min,150v,2h. 图谱不好，求高手指点，谢谢！  IMG_6548.jpg |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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8楼2013-09-11 16:28:42
yimingwang
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2楼2013-09-08 00:18:15
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3楼2013-09-08 22:12:16
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangbaocau(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2013-09-11 11:47:30
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zhangbaocau(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2013-09-11 11:47:30
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显然横纹众多，应该是聚焦不完全。 一般的和普遍的原因与对策： 1.样品没有完全溶解，上样前确保样品完全溶解并且保持稳定。 2.样品中存在干扰IEF的物质存在，改进样品制备方法，可用分子筛、超滤、透析等纯化蛋白质样品。 3.样品中可能存在干扰IEF的离子。可用超滤、透析等纯化蛋白质样品降低离子强度（离子浓度要小于10mmol/L)；或者用TCA、丙酮沉淀蛋白质，然后用缓冲溶液重新溶解被沉淀的蛋白质（当然弃去TCA、丙酮）。 4.做等电聚焦时离子型去垢剂太多时也会出现横纹，将样品用超滤、透析去掉离子型去垢剂，改用离子型去垢剂替代之。 5.聚焦时间过短使得聚焦不完全。需要适当延长聚焦时间。 6.聚焦时间过长，引起胶内渗水，并且改变了凝胶的内部的电场微环境，使得蛋白质样品再次发生移动，导致横纹。电泳时间不能过长。 7.楼主实验用的水是不是也有问题。应该用超纯水。 上样量应该还可以。 具体可以再讨论。 |
4楼2013-09-08 23:36:41
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