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【求助！】有关超滤离心管的问题 已有1人参与
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各位大虫好！ 先谢过大家了！ 最近在做一批蛋白 预实验中跑出来的蛋白条带都很模糊，就是整条条带弥散的很严重（如图） 感觉是因为样品中脂类什么的杂质太多了的原因。 所以想能不能用超滤离心管进行处理？ 不知道能不能啊？~~？~~如果可以该用什么规格的牌子的呢···该怎么用呢？ 蛋白样品量很少很少很少···估计目前也就5ml左右（各位见笑了···）真的是太少了··· 附图：  8.19-1.jpg  8.22.jpg  8.26-UV.jpg |
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【答案】应助回帖
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silicare: 金币+5, BioEPI+1 2013-09-04 08:24:41
silicare: 金币+5, BioEPI+1 2013-09-04 08:24:41
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用超滤管除去杂蛋白有点不靠谱，不推荐，也很难实现，去除弥散就更不可能了（也许是我孤陋寡闻。。。） 譬如你的蛋白是40KD的，你用了50KD膜的超滤管，你的蛋白不是都会通过膜的，会有部分通过膜，部分没有通过的，就算是10KD左右的杂蛋白也不会都通过膜的。 超滤管一般用来做蛋白的浓缩，或者更换缓冲液更多一点。提高蛋白纯度很难。一般常用的牌子是millipore的。 明显你的蛋白修饰比较多，不知道你的表达系统是什么，糖基化可能性高一点。你可以用糖基化酶进行酶切，如果是糖基化的话，酶切后应该会呈现出单一条带的。 |
6楼2013-09-02 13:37:09
2楼2013-08-30 10:22:11
3楼2013-08-30 20:36:25
4楼2013-09-01 06:44:30
5楼2013-09-02 08:47:54
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蒽蒽···那不知你觉得通过上面的SDS-PAGE的图觉得目前蛋白是出现了什么问题导致的这样的结果呢？ 我是想不知道能不能通过超滤管做一个除杂神马的···唔··· 做的是蜘蛛吐出来的消化液的电泳分析（预测是蛋白酶之类的） 加过loading buffer 比例1:1（体积比） 上样前煮沸5min，离心处理10000rpm/min，1min 上样量在10ul-15ul不等，marker上样5ul条带正常。 电泳后染色为25%无水乙醇，10%冰醋酸，0.1%的考马斯G-250混合，染色30min，固定液为25%异丙醇+10%冰醋酸混合，固定10min，脱色液为5%的无水乙醇，10%的冰醋酸混合，直至背景色褪去。 试剂配比： 1、分离胶缓冲液：Tirs 18.17g，SDS 0.4g 溶于水，用3mol/L HCl 调至pH8.8，加蒸馏水定容至100ml，其中Tris 为1.5mol/L，SDS为0.4% 2、浓缩胶缓冲液：Tris 6.0g，SDS 0.4g 溶于水，用3mol/L HCl 调至pH6.8，加蒸馏水定容至100ml，其中Tris为0.5mol/L，SDS为 0.4% 3、Arc/Bis：Arc 29.2g，Bis 0.8g 加蒸馏水溶解，定容至100ml，过滤后装入棕色试剂瓶，4℃避光保存。 4、10%过硫酸铵：1g过硫酸铵溶于10ml去离子水中。 5、1*SDS-样品缓冲液（10ml）：甘油 1.0g，SDS 0.2g，β-巯基乙醇 0.5ml，溴酚蓝 0.012%（W/V） 加0.25mol/L Tris-HCl（pH 6.8)到10.0ml 6、电极缓冲液：Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，SDS 1.0g，溶于蒸馏水（pH 8.3），定容至1000ml。 |
7楼2013-09-02 19:40:05
8楼2013-09-02 20:49:20
9楼2013-09-03 20:43:25
10楼2013-09-04 09:30:53