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greenygreen

银虫 (小有名气)

[求助] MTT实验求助

求助一个MTT实验问题:
我在最近的两次实验中,都出现了空白组(只有细胞,不加药组)根本不显色的现象。空白组和给药组的操作都是一样的:
96孔板,200ul 细胞悬液铺板,贴壁90%的时候给药;
包括调零组(只有培养基);空白组(细胞+DMSO);实验组(细胞+药——三个药物浓度);
37度孵育一小时;
各孔加20ul (5mg/ml) MTT溶液,37度孵育4小时显色;
MTT用无菌PBS配制,0.22um滤膜过滤除菌。
4小时之后发现给药组产生了蓝色晶体,但是空白组完全没有晶体产生。
显微镜下观察空白组细胞生长情况较好,为啥不显色呢!!!!

站内MTT的帖子虽然多,但是很多问题都没有解决方法。以上的操作也都严格按照MTT检测的操作进行的。

求助大神!
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gyesang

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【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-08-29 18:10:33
空白组你是加DMSO处理的,你是如何加的,有没有可能DMSO把细胞全杀死了,你看到的观察空白组细胞生长情况较好,细胞是活的吗?请认真观察一下哈
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-08-28 20:29:47
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greenygreen

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-08-28 20:29:47
空白组你是加DMSO处理的,你是如何加的,有没有可能DMSO把细胞全杀死了,你看到的观察空白组细胞生长情况较好,细胞是活的吗?请认真观察一下哈

DMSO是直接加入的,是不是应该先和培养基混了再加?
收细胞之前在显微镜下看了,空白组细胞长的很好的。虽然单是看不能保证细胞是活的,但真的没什么影响。
3楼2013-08-28 20:47:24
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
greenygreen: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-08-28 22:49:30
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-09-01 17:18:21
引用回帖:
3楼: Originally posted by greenygreen at 2013-08-28 20:47:24
DMSO是直接加入的,是不是应该先和培养基混了再加?
收细胞之前在显微镜下看了,空白组细胞长的很好的。虽然单是看不能保证细胞是活的,但真的没什么影响。...

我观察过,DNSO直接加进孔里,细胞瞬间就死了,加DMSO需要和培养基预混,加药也是一样,他们的密度比较大,局部浓度过大,瞬间就把细胞杀死了
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-08-28 22:10:24
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yilian

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
greenygreen: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-08-28 22:49:37
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-09-01 17:18:34
而且DMSO还有浓度要求的,小于5%比较安,最好1%以内

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
5楼2013-08-28 22:46:30
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greenygreen

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-08-28 22:10:24
我观察过,DNSO直接加进孔里,细胞瞬间就死了,加DMSO需要和培养基预混,加药也是一样,他们的密度比较大,局部浓度过大,瞬间就把细胞杀死了...

好吧~我试试!等待我的结果啊!
6楼2013-08-28 22:49:17
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yilian

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-29 18:10:45
不好意思,我写错了,是千分之五,就是0.5%比较安全,最好0.1%,我试过这两个浓度下细胞区别不是很大,不过能少就尽量少。
7楼2013-08-29 10:21:35
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倪言

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by yilian at 2013-08-28 22:46:30
而且DMSO还有浓度要求的,小于5%比较安,最好1%以内

DMSO只要是分析纯(国产,进口)就行了,还需要什么浓度要求?
爱生活爱自己
8楼2013-08-30 13:43:21
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yilian

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 倪言 at 2013-08-30 13:43:21
DMSO只要是分析纯(国产,进口)就行了,还需要什么浓度要求?...

这个浓度要求是指加入到细胞里面的终浓度,也就是溶剂对照,如果用DMSO,就要控制好浓度,因为DMSO对细胞是有毒害的
9楼2013-08-30 14:26:56
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gyesang

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引用回帖:
6楼: Originally posted by greenygreen at 2013-08-28 22:49:17
好吧~我试试!等待我的结果啊!...

期待你的结果!
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
10楼2013-08-30 18:05:30
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