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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关半定量实验结果图片的问题！！切切！1
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学术问题

银虫 (小有名气)

[求助] 有关半定量实验结果图片的问题！！切切！1

我是做了个梯度PCR  退火温度是 56  58度   但是条带特别的模糊  35个循环  求分析这是为什么？ 应该怎么办呢？ 我以前也没做过啊 （其中最亮的是内参，左侧是56度  右侧是58度  其他几个基因太模糊  能用吗？）
有关半定量实验结果图片的问题！！切切！1
56 58 退火(1234567+内参)swzx 2013-07-26 22hr 23min.jpg

[ Last edited by 学术问题 on 2013-7-27 at 10:35 ]
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微生物小硕
1楼 2013-07-27 10:33:40
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。热心的顾问 2013-07-27 13:53:19
出现多条带，而且有明显的引物二聚体，说明PCR效果差。可能是引物特异性不好、退火温度不合适，或者是模板质量不好。
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2楼2013-07-27 12:50:04
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普通回帖

biomed_fanyi

新虫 (初入文坛)
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-27 13:53:31
本帖内容被屏蔽
3楼2013-07-27 12:54:44
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孙妙妙

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的图标的不清楚，没发具体分析，还有你的引物设计的不行，怎么有那么多非特异扩增。另外半定量循环数一般不超出过30个，还有你是用的什么PCR体系，Mix还是分开Tag酶。有很多关于半定量的文章，可以好好看看，希望对你有帮助
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好好做实验！
4楼2013-07-27 15:57:15
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biomed_fanyi at 2013-07-27 12:54:44
我觉得是PCR没有成功。理想状态时其他样品都有一条和内参一样大小的带么？

详细说说你的实验设计吧- 这是测得不同样品中同一个基因？内参、样品模板分别是什么？

我的目的条带应该在100bp--300bp内   这个内参的引物我是直接在文献上找的，内参具体多大  我不太清楚 。分别是不同的基因，左侧是56度的退火温度，右侧是58度的退火温度。我是不是应该在提高退火温度？？我今天刚做了个59度的退火温度，结果还没出来。。内参是 肌动蛋白，样品模板是cDNA。
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微生物小硕
5楼2013-07-27 17:09:43
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 孙妙妙 at 2013-07-27 15:57:15
你的图标的不清楚，没发具体分析，还有你的引物设计的不行，怎么有那么多非特异扩增。另外半定量循环数一般不超出过30个，还有你是用的什么PCR体系，Mix还是分开Tag酶。有很多关于半定量的文章，可以好好看看，希望 ...

我的目的条带应该在100bp--300bp内   这个内参的引物我是直接在文献上找的，内参具体多大  我不太清楚 。分别是不同的基因，左侧是56度的退火温度，右侧是58度的退火温度。我是不是应该在提高退火温度？？我今天刚做了个59度的退火温度，结果还没出来。。内参是 肌动蛋白，样品模板是cDNA。我用的是mix   不过还是谢谢你啊！！   真心不知道该怎么做了
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微生物小硕
6楼2013-07-27 17:11:07
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taojun

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的引物二聚体太大了啊，你可以把你的特异性引物给我看看吗？我觉得是你的引物设计了有问题了，还有就是你找的退火温度有问题，感觉你的退火温度有点低，这样会出现一些非特异性条带！
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7楼2013-07-27 17:32:23
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370769676

银虫 (正式写手)
个人感觉退火温度要升高，再不行那就是你的引物特异性的问题了！
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8楼2013-07-27 23:29:50
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zgb1982

木虫 (正式写手)
内参35太多，过亮了，目标基因循环数要看模版浓度和基因表达量
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9楼2013-07-28 11:03:19
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孙妙妙

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
学术问题: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-28 17:08:44
引用回帖:
6楼: Originally posted by 学术问题 at 2013-07-27 17:11:07
我的目的条带应该在100bp--300bp内   这个内参的引物我是直接在文献上找的，内参具体多大  我不太清楚 。分别是不同的基因，左侧是56度的退火温度，右侧是58度的退火温度。我是不是应该在提高退火温度？？我今天刚 ...

半定量是需要摸索循环数加样量及退火温度的，你内参的引物应该是没有问题的，但你那个亮度，一看就是超过阈值很多，一般内参22-26个循环最多了。我说的引物有问题的是你的目的基因引物，我们一般做出来都是只有1条带的，你那个每个都有很多，说明引物非特异。同时你循环数那么多也可能是引起非特异的主要原因。希望有帮助
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好好做实验！
10楼2013-07-28 16:29:52
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