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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR 间隔的重复序列缺失
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zz418841988

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR 间隔的重复序列缺失 已有1人参与

基因全长942bp,在克隆载体中测序完全正确 ，设计引物PCR扩全长换载体时有缺失：
（2处20bp的重复序列间隔41个碱基），送测了多个样品测序，都是同样的缺失，缺失了61个碱基，缺失了一个重复序列和其中间隔的41个碱基。希望有高手指点，谢谢！
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分子生化实验经验积累 重复序列PCR扩增

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1楼 2013-07-17 10:35:02
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shanqian1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-17 11:53:19
同时送个克隆载体的质粒测序看看吧，我觉得是不是模板搞错了？
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2楼2013-07-17 11:08:16
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zz418841988

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shanqian1988 at 2013-07-17 11:08:16
同时送个克隆载体的质粒测序看看吧，我觉得是不是模板搞错了？

谢谢回复，模板没有搞错，这一点可以肯定；我已经两次碰到同样的问题了，都是缺失了一个重复序列和其中的间隔序列。我用的是DNA polymerase .
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3楼2013-07-17 12:02:59
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-17 13:50:41
建议把原始的测序序列再重新测序验证下下。
另外如果不好扩增，那可以多抽点质粒直接用双酶切，再跟别外一个载体连连呗，最多是费点酶。也不用那么纠结
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4楼2013-07-17 12:50:24
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zz418841988

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 12:50:24
建议把原始的测序序列再重新测序验证下下。
另外如果不好扩增，那可以多抽点质粒直接用双酶切，再跟别外一个载体连连呗，最多是费点酶。也不用那么纠结

模板质粒重新测序验证过了，所以才说模板质粒没问题的。克隆载体中没有合适的酶切位点，不能直接做酶切连接。我是觉得在PCR反应的过程中，Pfu DNA polymerase 跳过了一个重复序列和重复序列中间的间隔碱基，造成了一个重复序列和和重复序列中间的间隔碱基的缺失。不知道各位高手有没有碰到的这们的问题？又是怎么解决的？谢谢！
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5楼2013-07-17 13:18:06
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zz418841988

新虫 (初入文坛)
自己再顶一次，之前说的不是太清楚，现在再补上一张图片，
方框中是重复序列，红色部分是缺失了的序列，缺失了一个重复序列和两个重复序列的间隔序列，测了多个样品都是同样的缺失。不知道各位大侠有没有碰到这样的问题？又是怎么解决的？谢谢！
PCR 间隔的重复序列缺失
PCR 缺失.jpg
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6楼2013-07-17 15:18:07
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
6楼: Originally posted by zz418841988 at 2013-07-17 15:18:07
自己再顶一次，之前说的不是太清楚，现在再补上一张图片，
方框中是重复序列，红色部分是缺失了的序列，缺失了一个重复序列和两个重复序列的间隔序列，测了多个样品都是同样的缺失。不知道各位大侠有没有碰到这样的 ...

这个问题，似乎无解，我曾经通过PCR扩增SV40启动子，SV40启动子里面有两个72bp增强子的正向重复，无论怎么扩，就是丢失一个72bp拷贝，这个问题我实验室其他人也碰到过，至今找不到解决的办法，似乎我们需要对PCR的扩增过程有个重新的认识，并不是线性的，可能存在一个空间结构而产生跳跃
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2013-07-17 16:02:32
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zz418841988

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-17 16:02:32
这个问题，似乎无解，我曾经通过PCR扩增SV40启动子，SV40启动子里面有两个72bp增强子的正向重复，无论怎么扩，就是丢失一个72bp拷贝，这个问题我实验室其他人也碰到过，至今找不到解决的办法，似乎我们需要对PCR的 ...

谢谢分享，这条序列我一共送测了10个克隆，有2个克隆是没有缺失的，其余8个缺失了同样的碱基。可能PCR扩增确实有时产生了跳跃，只是不知道其机理是什么样的。
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8楼2013-07-17 21:19:48
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zz418841988 at 2013-07-17 15:18:07
自己再顶一次，之前说的不是太清楚，现在再补上一张图片，
方框中是重复序列，红色部分是缺失了的序列，缺失了一个重复序列和两个重复序列的间隔序列，测了多个样品都是同样的缺失。不知道各位大侠有没有碰到这样的 ...

你好，这一段序列是编码区还是非编码区，如果是前者的话就应该考虑真假基因；如果是非编码区的话就有可能是因为多个重复，而你的引物刚好位于重复区，扩增的时候跳过了一个重复。我是做线粒体的，线粒体控制区种一般有多个重复，但是不会出现你说的这种情况。祝好运！
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
9楼2013-12-05 11:18:03
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lqz816

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也遇到此问题，200多bp的顺向重复丢了一个，没有一个克隆是正确的。查了一下资料，把获得的信息写到这，供后来搜索到此贴的人参考。出现所说现象可能和基因多样性分析时遇到的PCR recombination 或称为chimera formation是同样的现象，原因也是一样的。原因有两个：未完全延伸产物链的出现及template-switching .具体参考此综述（此文后部分很详细解释）：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16233530
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10楼2014-08-12 23:41:24
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