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zz418841988

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR 间隔的重复序列缺失 已有1人参与

基因全长942bp,在克隆载体中测序完全正确 ,设计引物PCR扩全长换载体时有缺失:
(2处20bp的重复序列间隔41个碱基),送测了多个样品测序,都是同样的缺失,缺失了61个碱基,缺失了一个重复序列和其中间隔的41个碱基。希望有高手指点,谢谢!
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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引用回帖:
6楼: Originally posted by zz418841988 at 2013-07-17 15:18:07
自己再顶一次,之前说的不是太清楚,现在再补上一张图片,
方框中是重复序列,红色部分是缺失了的序列,缺失了一个重复序列和两个重复序列的间隔序列,测了多个样品都是同样的缺失。不知道各位大侠有没有碰到这样的 ...

这个问题,似乎无解,我曾经通过PCR扩增SV40启动子,SV40启动子里面有两个72bp增强子的正向重复,无论怎么扩,就是丢失一个72bp拷贝,这个问题我实验室其他人也碰到过,至今找不到解决的办法,似乎我们需要对PCR的扩增过程有个重新的认识,并不是线性的,可能存在一个空间结构而产生跳跃
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2013-07-17 16:02:32
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shanqian1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你的更多精彩 2013-07-17 11:53:19
同时送个克隆载体的质粒测序看看吧,我觉得是不是模板搞错了?
2楼2013-07-17 11:08:16
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zz418841988

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shanqian1988 at 2013-07-17 11:08:16
同时送个克隆载体的质粒测序看看吧,我觉得是不是模板搞错了?

谢谢回复,模板没有搞错,这一点可以肯定;我已经两次碰到同样的问题了,都是缺失了一个重复序列和其中的间隔序列。我用的是DNA polymerase .
3楼2013-07-17 12:02:59
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-17 13:50:41
建议把原始的测序序列再重新测序验证下下。
另外如果不好扩增,那可以多抽点质粒直接用双酶切,再跟别外一个载体连连呗,最多是费点酶。也不用那么纠结
4楼2013-07-17 12:50:24
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