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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR 间隔的重复序列缺失
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zz418841988

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR 间隔的重复序列缺失 已有1人参与

基因全长942bp,在克隆载体中测序完全正确 ，设计引物PCR扩全长换载体时有缺失：
（2处20bp的重复序列间隔41个碱基），送测了多个样品测序，都是同样的缺失，缺失了61个碱基，缺失了一个重复序列和其中间隔的41个碱基。希望有高手指点，谢谢！
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分子生化实验经验积累 重复序列PCR扩增

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1楼 2013-07-17 10:35:02
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zz418841988

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shanqian1988 at 2013-07-17 11:08:16
同时送个克隆载体的质粒测序看看吧，我觉得是不是模板搞错了？

谢谢回复，模板没有搞错，这一点可以肯定；我已经两次碰到同样的问题了，都是缺失了一个重复序列和其中的间隔序列。我用的是DNA polymerase .
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3楼2013-07-17 12:02:59
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shanqian1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-17 11:53:19
同时送个克隆载体的质粒测序看看吧，我觉得是不是模板搞错了？
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2楼2013-07-17 11:08:16
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-17 13:50:41
建议把原始的测序序列再重新测序验证下下。
另外如果不好扩增，那可以多抽点质粒直接用双酶切，再跟别外一个载体连连呗，最多是费点酶。也不用那么纠结
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4楼2013-07-17 12:50:24
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zz418841988

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 12:50:24
建议把原始的测序序列再重新测序验证下下。
另外如果不好扩增，那可以多抽点质粒直接用双酶切，再跟别外一个载体连连呗，最多是费点酶。也不用那么纠结

模板质粒重新测序验证过了，所以才说模板质粒没问题的。克隆载体中没有合适的酶切位点，不能直接做酶切连接。我是觉得在PCR反应的过程中，Pfu DNA polymerase 跳过了一个重复序列和重复序列中间的间隔碱基，造成了一个重复序列和和重复序列中间的间隔碱基的缺失。不知道各位高手有没有碰到的这们的问题？又是怎么解决的？谢谢！
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5楼2013-07-17 13:18:06
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