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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB结果杂不出目的条带，只有特别亮的非特异性条带，求高手解释原因
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
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1楼 2013-07-08 09:51:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+2, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-08 16:27:29
silicare: BioEPI+1 2013-07-09 09:47:57
我想先问一下你的阳性对照是什么，各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带？抗体是自己做还是公司买的现成抗体？
做western有非特异条带也是很正常的，有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白样品的反复冻融对有些蛋白来说可能会降解比较严重，也可能导致western失败。
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2楼2013-07-08 14:02:18
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-08 14:02:18
我想先问一下你的阳性对照是什么，各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带？抗体是自己做还是公司买的现成抗体？
做western有非特异条带也是很正常的，有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白 ...

我的实验是用慢病毒制备转基因鸡，阳性对照是细胞实验时用病毒感染细胞后提取的蛋白，后来在鸡的组织蛋白样品中杂到与细胞实验相同的条带，所以认定这段时间杂出的下面那排很粗的是非特异性条带。
       这段时间WB样品用的是从鸡蛋里提的蛋白，我分别用PEG6000和氯仿两种方法提取，PEG法始终未杂出目的条带，氯仿法提的就杂出一次如图的条带。GFP抗体是买的博尔迈公司的，杂浓度很低的标准品都没问题的。
     蛋白样品反复冻融确实会降解，但是我只冻融两次应该不会完全降解啊，而且样品溶解都是插在冰盒里的。我又重新提蛋白的还没杂出来，过一个月就该汇报工作了，很焦急。
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3楼2013-07-08 14:19:13
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-08 14:02:18
我想先问一下你的阳性对照是什么，各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带？抗体是自己做还是公司买的现成抗体？
做western有非特异条带也是很正常的，有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白 ...

PS，这个非特异性条带出现在CK和样品孔，而阳性对照都没出现，小硕水平有限，请不吝赐教啊
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4楼2013-07-08 14:33:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-09 08:18:49
引用回帖:
3楼: Originally posted by 浮帅古 at 2013-07-08 14:19:13
我的实验是用慢病毒制备转基因鸡，阳性对照是细胞实验时用病毒感染细胞后提取的蛋白，后来在鸡的组织蛋白样品中杂到与细胞实验相同的条带，所以认定这段时间杂出的下面那排很粗的是非特异性条带。
       这段时间 ...

根据你所说的和我的理解，阳性对照用的是细胞样品，不是鸡的样品？而且你在目的蛋白上融合了GFP，所以用GFP抗体检测？如果是这样，你可以用GFP特异荧光检测目标蛋白的表达情况。
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5楼2013-07-09 00:42:08
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darkarrow

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+2, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-09 08:18:41
silicare: BioEPI+1 2013-07-09 09:48:16
一般来说这种问题都是和抗体得质量有关。看你第一张图，第二条泳道像是control，因为只有非特异性得那一条带，说明你得抗体对于那个蛋白有更强得affinity，这样得话，再相同孵育得条件下，非特异性蛋白结合得抗体更多，所以显色得时候就非常轻易得就出信号，而你得目的条带信号弱，需要相对比较长得时间。你可以尝试这样做，先短曝光，小心得把信号强得那段相应得膜剪掉，然后用更长得时间来曝光你得目的条带。western得影响因素很多，重复不出来也很正常。对于western样品得制备，最好得办法就是直接往细胞里加上样buffer，这样得重复性会好些。
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浮帅古
6楼2013-07-09 03:33:07
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-09 00:42:08
根据你所说的和我的理解，阳性对照用的是细胞样品，不是鸡的样品？而且你在目的蛋白上融合了GFP，所以用GFP抗体检测？如果是这样，你可以用GFP特异荧光检测目标蛋白的表达情况。...

cicelyzh老师很在行，我没有用鸡的样品做对照，因为用的广泛启动子在鸡上表达很弱。
我试过看蛋里的荧光，可能是鸡蛋里其他蛋白和脂肪类的干扰，没有看到荧光。
我的计划是做WB定性，然后做ELISA来定量，做了一次ELISA但是没出来，所有又回到WB想先做出个结果。
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7楼2013-07-09 08:57:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 浮帅古 at 2013-07-09 08:57:24
cicelyzh老师很在行，我没有用鸡的样品做对照，因为用的广泛启动子在鸡上表达很弱。
我试过看蛋里的荧光，可能是鸡蛋里其他蛋白和脂肪类的干扰，没有看到荧光。
我的计划是做WB定性，然后做ELISA来定量，做了一次 ...

如果启动子不强是可能看不到荧光。如果你认为一定有表达的话，买的GFP抗体不应该有很强非特异条带。你可以用未转基因鸡的样品做负对照。如果细胞样品的表达量比较高，可能需要稀释正对照使其与鸡组织样品的表达量在同一范围便于观测和定量，同时调整一抗的稀释倍数和鸡组织样品的上样量。
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8楼2013-07-09 11:57:43
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
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6楼: Originally posted by darkarrow at 2013-07-09 03:33:07
一般来说这种问题都是和抗体得质量有关。看你第一张图，第二条泳道像是control，因为只有非特异性得那一条带，说明你得抗体对于那个蛋白有更强得affinity，这样得话，再相同孵育得条件下，非特异性蛋白结合得抗体更 ...

感谢darkarrow的建议，中午显影时我先曝光一次后把信号强的那段膜剪掉了，然后重新加发光液显影了六七分钟，但仍未没有杂出目的条带，我现在怀疑是不是蛋白没有表达……
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9楼2013-07-09 17:20:18
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-09 11:57:43
如果启动子不强是可能看不到荧光。如果你认为一定有表达的话，买的GFP抗体不应该有很强非特异条带。你可以用未转基因鸡的样品做负对照。如果细胞样品的表达量比较高，可能需要稀释正对照使其与鸡组织样品的表达量在 ...

感谢cicelyzh老师的建议，阳性对照我每次上10微克然后加loading buffer补齐，样品我50到120都试过，唯一跑出来那次是上了50微克。

这次我分别用了两家公司的GFP抗体，结果都和以前一样，都是只有非特异性条带，我把非特异性那段膜剪去后，长时间曝光仍未杂出目的条带。

有一点可能是，我用文献上的从鸡蛋里提蛋白的步骤，其中没有加蛋白酶抑制剂的，所以我也一直没加过，我想会不会是因为没有加抑制剂所以降解了。我后天再提一次蛋白，提过后在里面加点PMSF然后立刻煮样跑胶。

如果还是没有的话，也许就是蛋白没有表达，我只能向老板汇报了……
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10楼2013-07-09 17:39:43
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