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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB结果杂不出目的条带，只有特别亮的非特异性条带，求高手解释原因
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
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1楼 2013-07-08 09:51:19
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darkarrow

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+2, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-09 08:18:41
silicare: BioEPI+1 2013-07-09 09:48:16
一般来说这种问题都是和抗体得质量有关。看你第一张图，第二条泳道像是control，因为只有非特异性得那一条带，说明你得抗体对于那个蛋白有更强得affinity，这样得话，再相同孵育得条件下，非特异性蛋白结合得抗体更多，所以显色得时候就非常轻易得就出信号，而你得目的条带信号弱，需要相对比较长得时间。你可以尝试这样做，先短曝光，小心得把信号强得那段相应得膜剪掉，然后用更长得时间来曝光你得目的条带。western得影响因素很多，重复不出来也很正常。对于western样品得制备，最好得办法就是直接往细胞里加上样buffer，这样得重复性会好些。
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浮帅古
6楼2013-07-09 03:33:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+2, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-08 16:27:29
silicare: BioEPI+1 2013-07-09 09:47:57
我想先问一下你的阳性对照是什么，各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带？抗体是自己做还是公司买的现成抗体？
做western有非特异条带也是很正常的，有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白样品的反复冻融对有些蛋白来说可能会降解比较严重，也可能导致western失败。
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2楼2013-07-08 14:02:18
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-08 14:02:18
我想先问一下你的阳性对照是什么，各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带？抗体是自己做还是公司买的现成抗体？
做western有非特异条带也是很正常的，有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白 ...

我的实验是用慢病毒制备转基因鸡，阳性对照是细胞实验时用病毒感染细胞后提取的蛋白，后来在鸡的组织蛋白样品中杂到与细胞实验相同的条带，所以认定这段时间杂出的下面那排很粗的是非特异性条带。
       这段时间WB样品用的是从鸡蛋里提的蛋白，我分别用PEG6000和氯仿两种方法提取，PEG法始终未杂出目的条带，氯仿法提的就杂出一次如图的条带。GFP抗体是买的博尔迈公司的，杂浓度很低的标准品都没问题的。
     蛋白样品反复冻融确实会降解，但是我只冻融两次应该不会完全降解啊，而且样品溶解都是插在冰盒里的。我又重新提蛋白的还没杂出来，过一个月就该汇报工作了，很焦急。
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努力爱！
3楼2013-07-08 14:19:13
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-08 14:02:18
我想先问一下你的阳性对照是什么，各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带？抗体是自己做还是公司买的现成抗体？
做western有非特异条带也是很正常的，有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白 ...

PS，这个非特异性条带出现在CK和样品孔，而阳性对照都没出现，小硕水平有限，请不吝赐教啊
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努力爱！
4楼2013-07-08 14:33:44
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