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浮帅古

铜虫 (小有名气)

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浮帅古

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-08 14:02:18
我想先问一下你的阳性对照是什么,各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带?抗体是自己做还是公司买的现成抗体?
做western有非特异条带也是很正常的,有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白 ...

我的实验是用慢病毒制备转基因鸡,阳性对照是细胞实验时用病毒感染细胞后提取的蛋白,后来在鸡的组织蛋白样品中杂到与细胞实验相同的条带,所以认定这段时间杂出的下面那排很粗的是非特异性条带。
       这段时间WB样品用的是从鸡蛋里提的蛋白,我分别用PEG6000和氯仿两种方法提取,PEG法始终未杂出目的条带,氯仿法提的就杂出一次如图的条带。GFP抗体是买的博尔迈公司的,杂浓度很低的标准品都没问题的。
     蛋白样品反复冻融确实会降解,但是我只冻融两次应该不会完全降解啊,而且样品溶解都是插在冰盒里的。我又重新提蛋白的还没杂出来,过一个月就该汇报工作了,很焦急。
努力爱!
3楼2013-07-08 14:19:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
137167741: 金币+2, 小木虫交流,共同进步~~ 2013-07-08 16:27:29
silicare: BioEPI+1 2013-07-09 09:47:57
我想先问一下你的阳性对照是什么,各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带?抗体是自己做还是公司买的现成抗体?
做western有非特异条带也是很正常的,有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白样品的反复冻融对有些蛋白来说可能会降解比较严重,也可能导致western失败。
2楼2013-07-08 14:02:18
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浮帅古

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-08 14:02:18
我想先问一下你的阳性对照是什么,各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带?抗体是自己做还是公司买的现成抗体?
做western有非特异条带也是很正常的,有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白 ...

PS,这个非特异性条带出现在CK和样品孔,而阳性对照都没出现,小硕水平有限,请不吝赐教啊
努力爱!
4楼2013-07-08 14:33:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


137167741: 金币+1, 小木虫交流,共同进步~~ 2013-07-09 08:18:49
引用回帖:
3楼: Originally posted by 浮帅古 at 2013-07-08 14:19:13
我的实验是用慢病毒制备转基因鸡,阳性对照是细胞实验时用病毒感染细胞后提取的蛋白,后来在鸡的组织蛋白样品中杂到与细胞实验相同的条带,所以认定这段时间杂出的下面那排很粗的是非特异性条带。
       这段时间 ...

根据你所说的和我的理解,阳性对照用的是细胞样品,不是鸡的样品?而且你在目的蛋白上融合了GFP,所以用GFP抗体检测?如果是这样,你可以用GFP特异荧光检测目标蛋白的表达情况。
5楼2013-07-09 00:42:08
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