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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB结果杂不出目的条带，只有特别亮的非特异性条带，求高手解释原因
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
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1楼 2013-07-08 09:51:19
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-09 11:57:43
如果启动子不强是可能看不到荧光。如果你认为一定有表达的话，买的GFP抗体不应该有很强非特异条带。你可以用未转基因鸡的样品做负对照。如果细胞样品的表达量比较高，可能需要稀释正对照使其与鸡组织样品的表达量在 ...

感谢cicelyzh老师的建议，阳性对照我每次上10微克然后加loading buffer补齐，样品我50到120都试过，唯一跑出来那次是上了50微克。

这次我分别用了两家公司的GFP抗体，结果都和以前一样，都是只有非特异性条带，我把非特异性那段膜剪去后，长时间曝光仍未杂出目的条带。

有一点可能是，我用文献上的从鸡蛋里提蛋白的步骤，其中没有加蛋白酶抑制剂的，所以我也一直没加过，我想会不会是因为没有加抑制剂所以降解了。我后天再提一次蛋白，提过后在里面加点PMSF然后立刻煮样跑胶。

如果还是没有的话，也许就是蛋白没有表达，我只能向老板汇报了……
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10楼2013-07-09 17:39:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+2, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-07-08 16:27:29
silicare: BioEPI+1 2013-07-09 09:47:57
我想先问一下你的阳性对照是什么，各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带？抗体是自己做还是公司买的现成抗体？
做western有非特异条带也是很正常的，有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白样品的反复冻融对有些蛋白来说可能会降解比较严重，也可能导致western失败。
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2楼2013-07-08 14:02:18
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-08 14:02:18
我想先问一下你的阳性对照是什么，各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带？抗体是自己做还是公司买的现成抗体？
做western有非特异条带也是很正常的，有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白 ...

我的实验是用慢病毒制备转基因鸡，阳性对照是细胞实验时用病毒感染细胞后提取的蛋白，后来在鸡的组织蛋白样品中杂到与细胞实验相同的条带，所以认定这段时间杂出的下面那排很粗的是非特异性条带。
       这段时间WB样品用的是从鸡蛋里提的蛋白，我分别用PEG6000和氯仿两种方法提取，PEG法始终未杂出目的条带，氯仿法提的就杂出一次如图的条带。GFP抗体是买的博尔迈公司的，杂浓度很低的标准品都没问题的。
     蛋白样品反复冻融确实会降解，但是我只冻融两次应该不会完全降解啊，而且样品溶解都是插在冰盒里的。我又重新提蛋白的还没杂出来，过一个月就该汇报工作了，很焦急。
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3楼2013-07-08 14:19:13
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浮帅古

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-08 14:02:18
我想先问一下你的阳性对照是什么，各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带？抗体是自己做还是公司买的现成抗体？
做western有非特异条带也是很正常的，有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白 ...

PS，这个非特异性条带出现在CK和样品孔，而阳性对照都没出现，小硕水平有限，请不吝赐教啊
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4楼2013-07-08 14:33:44
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