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浮帅古

铜虫 (小有名气)

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 浮帅古 at 2013-07-09 08:57:24
cicelyzh老师很在行,我没有用鸡的样品做对照,因为用的广泛启动子在鸡上表达很弱。
我试过看蛋里的荧光,可能是鸡蛋里其他蛋白和脂肪类的干扰,没有看到荧光。
我的计划是做WB定性,然后做ELISA来定量,做了一次 ...

如果启动子不强是可能看不到荧光。如果你认为一定有表达的话,买的GFP抗体不应该有很强非特异条带。你可以用未转基因鸡的样品做负对照。如果细胞样品的表达量比较高,可能需要稀释正对照使其与鸡组织样品的表达量在同一范围便于观测和定量,同时调整一抗的稀释倍数和鸡组织样品的上样量。
8楼2013-07-09 11:57:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
137167741: 金币+2, 小木虫交流,共同进步~~ 2013-07-08 16:27:29
silicare: BioEPI+1 2013-07-09 09:47:57
我想先问一下你的阳性对照是什么,各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带?抗体是自己做还是公司买的现成抗体?
做western有非特异条带也是很正常的,有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白样品的反复冻融对有些蛋白来说可能会降解比较严重,也可能导致western失败。
2楼2013-07-08 14:02:18
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浮帅古

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-08 14:02:18
我想先问一下你的阳性对照是什么,各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带?抗体是自己做还是公司买的现成抗体?
做western有非特异条带也是很正常的,有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白 ...

我的实验是用慢病毒制备转基因鸡,阳性对照是细胞实验时用病毒感染细胞后提取的蛋白,后来在鸡的组织蛋白样品中杂到与细胞实验相同的条带,所以认定这段时间杂出的下面那排很粗的是非特异性条带。
       这段时间WB样品用的是从鸡蛋里提的蛋白,我分别用PEG6000和氯仿两种方法提取,PEG法始终未杂出目的条带,氯仿法提的就杂出一次如图的条带。GFP抗体是买的博尔迈公司的,杂浓度很低的标准品都没问题的。
     蛋白样品反复冻融确实会降解,但是我只冻融两次应该不会完全降解啊,而且样品溶解都是插在冰盒里的。我又重新提蛋白的还没杂出来,过一个月就该汇报工作了,很焦急。
努力爱!
3楼2013-07-08 14:19:13
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浮帅古

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-08 14:02:18
我想先问一下你的阳性对照是什么,各个样品又是什么。你如何确定样品中的是非特异条带?抗体是自己做还是公司买的现成抗体?
做western有非特异条带也是很正常的,有时候的确是非特异带比目标蛋白带的信号强。蛋白 ...

PS,这个非特异性条带出现在CK和样品孔,而阳性对照都没出现,小硕水平有限,请不吝赐教啊
努力爱!
4楼2013-07-08 14:33:44
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