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gq十三少

银虫 (小有名气)

[交流] 噬菌体展示肽库淘选

我现在在做噬菌体展示，遇到了如下几个问题：
1.我开始做的时候第三轮时突然没有了蓝斑，我第一开始认为是污染了，可是当我重新铺板挑单菌落然后摇菌后，蓝斑又神奇的出现了。我想问，是不是每次都要重新挑菌然后摇菌才能使用，大家一般要多长时间呢？（PS：我用的菌是NEB的7肽和12肽的试剂盒中给的菌，学姐说这个给的菌没有他以前做的活力好）
2.IPTG/Xgal是每次都要现用现配的么？
3.我曾经稀释过扩增后的噬菌体，可是效果跟我没有稀释的时候没有太大差别。所以我一直都没有稀释，而且最多我也就稀释10倍，100倍，1000倍。想学习一下大家的经验~
4.每次我用菌铺板后测滴度后，板上都会涨满了菌，所以我就把200μL改成了100μL，60μL，50μL，结果并没有好很多，还是一大片一大片的不规则蓝斑，很难穿刺~我想询问一下大家测滴度是什么样的呢，大家使用的是200μL的菌么？
5.还有我穿刺了四个蓝色的菌斑以后去测序，却测不出来。我曾经给客服联系，他说有篮板就应该有东西，就应该测到，他说要我去问测序公司原因，如果量太少就增加量，而且换一家好的测序公司。目前我们不可能换测序公司，而且他并没有说明什么原因。我只能从自己这里找原因，有可能是：我把菌降低到60μL的原因么？还是我的测滴度的板子培养的时间过长，我每次都不超过18H。希望有经验的人能指点一下？
感谢大家看完我的帖子，也希望有同做噬菌体的研究朋友交流一下，因为这个试验周期很长，我一般都是7个肽的做四轮，取三四轮，12个肽的做五轮，取四五轮，所以希望大家能互相交流，把实验做得更好，谢谢
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1楼 2013-07-03 09:50:17
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小五来了

金虫 (小有名气)
★ ★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-04 13:42:43
我感觉你是完全没有按照NEB给你的说明书做实验，感觉你做的很多都有问题，IPTG不需要先配现用，还有你稀释与不稀释都相同，这肯定是你测的问题，不可能是没有区别的，扩增后的噬菌体一般都是在10的11次方到13次方之间，你说你就稀释一千倍，怎么可能挑取到单个蓝斑，还有那个测滴度的菌，200微升是可以的，
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2楼2013-07-04 10:50:55
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qysh2011

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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2楼: Originally posted by 小五来了 at 2013-07-04 10:50:55
我感觉你是完全没有按照NEB给你的说明书做实验，感觉你做的很多都有问题，IPTG不需要先配现用，还有你稀释与不稀释都相同，这肯定是你测的问题，不可能是没有区别的，扩增后的噬菌体一般都是在10的11次方到13次方之 ...

想问下筛选过程中应注意哪些问题啊？谢谢你哦！
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3楼2013-08-31 16:29:27
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小五来了

金虫 (小有名气)
★
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3楼: Originally posted by qysh2011 at 2013-08-31 16:29:27
想问下筛选过程中应注意哪些问题啊？谢谢你哦！...

筛选尽量不要污染了野生型噬菌体，这个最难办，第一轮扩增产物是绝对不能有野生型的，要是第一轮就有野生型污染的话，那第三轮基本就全是野生型的了。其他的倒没什么
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4楼2013-09-01 09:46:49
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80140333

新虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
2楼: Originally posted by 小五来了 at 2013-07-04 10:50:55
我感觉你是完全没有按照NEB给你的说明书做实验，感觉你做的很多都有问题，IPTG不需要先配现用，还有你稀释与不稀释都相同，这肯定是你测的问题，不可能是没有区别的，扩增后的噬菌体一般都是在10的11次方到13次方之 ...

11次方-13次方？不会吧稀释这么大的吧，一般就是8-11次方
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5楼2014-07-10 19:05:55
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翟小翟

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by 80140333 at 2014-07-10 19:05:55
11次方-13次方？不会吧稀释这么大的吧，一般就是8-11次方...

他说的应该是滴度为11次方和13次方 而不是稀释 稀释到-9
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6楼2015-07-02 11:06:52
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