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jannver

铁虫 (小有名气)

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[求助] 请教DNA电泳问题，使用SYBR Green I 染色

请教DNA电泳问题，使用SYBR Green I 染色

我的操作简述如下：

1、2%低熔点琼脂糖100ml，加热后放凉到60度时，加入SYBR Green I 原液10ul，混匀后制胶。

2、将样品和loading buffer 按常规比例体积混合，10min后上样。

3、上样体积10ul，我的样品浓度约在200 nM。

4、电泳条件：70V（7V/cm），0.5 TBE Buffer，冰水浴电泳，3h。

5、我设了两个Ladder，一个范围是49kb~0.8kb，另一个范围是500bp~25bp。

这个实验重复了两层，结果类似，都好像有问题：

1、在电泳开始不久就发现样品条带有黄绿色带条出现，电泳结束是黄绿色带条变的很粗（信号强）。

2、目的条带和Ladder情况：

（1）M1 范围是49kb~0.8kb的Ladder 没有分离开，只出现3条带。
（2）M2范围是500bp~25bp的Ladder 有分开，但信号很弱（可能是我的上样浓度小了）。
（3）我的目的条带都应该在23kb附近，但是电泳结果信号都处于50bp，而且条带间横向没有分开，全连在一起了。
（4）我的目的条带理论上应该有梯带出现，但是没有出现。

说明：我的实验是用若干条序列彼此部分互补的50bp的单链DNA作为原料，通过缓慢淬火，使之形成DNA纳米结构，目标产物大小应该在23kb。

我的疑问是：

1、我的实验设计是不是有问题，根本没有形成纳米结构，所以电泳结果条带仍然是50bp，与原料很近。

2、是不是SYBR Green I 制胶的方法有误，不应该将SYBR Green I 直接加到胶里，而应该和样品预混后再上样才好。

3、是不是我的上样体积或样品浓度太大?

谢谢，希望得到高手指教。

20130628_2208.jpg

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