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urbest金虫 (正式写手)
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[求助]
求助——质粒构建问题
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事情是这样的，我最近在构建一个质粒，将一个DNA片段使用引物扩增后，DNA和质粒均做双酶切，T4连接，转化、图板、挑克隆、摇菌、抽质粒。 我将质粒作为模板，使用引物扩增，某些质粒可以扩出目的条带，将PCR产物测序，得到正确的序列。 然后我吸取5ul阳性质粒的菌液，放入5ml LB培养基+氨苄，重新摇菌抽质粒，这次直接拿质粒测序，结果测序结果杂乱无比，全是杂峰。 然后我就用上次抽出来的测序正确的质粒重新转化、图板、挑克隆、摇菌，抽质粒，得到的质粒再次进行PCR，多次均未得到目的条带，只有几千bp那里有条带。应该不是PCR技术的问题，因为我拿第一次的质粒做了阳性对照，可以P出来。 难道拿正确的质粒重新转化，再挑克隆出来的质粒，跟老质粒会不一样吗？或者干脆就是杂菌？我加了氨苄了啊。 我现在应该怎么办？拿第一次的菌板出来重新挑克隆，还是从头开始重新构建质粒，或者有什么别的办法？ 这到底是怎么回事，真心求指导。 [ Last edited by 1949stone on 2013-6-25 at 12:25 ] |
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首先一点就是，你扩增出目的条带后，送测序的不应该是PCR产物。 我建议的步骤是： 1，将DNA片段使用引物扩增后，DNA和质粒均做双酶切，T4连接，转化、涂板。 2，做菌落PCR，跑胶后，眺取有目的条带的菌落放入5ml LB培养基+氨苄，提质粒。（如果菌落太小，可以直接多挑一些单菌落，直接摇5ml LB培养基+氨苄，之后做菌液PCR） 3，如果觉得不放心，可以将提出来的质粒作为模板，做质粒PCR。 4，送测序。 |
3楼2013-06-25 14:10:35
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建议： 1. PCR 扩增目的条带，连接到T载体上，转化涂板，挑单克隆，PCR检测有目的条带的单克隆挑选出来测序。 2. 用测序正确的单克隆，摇菌，提质粒 3. 将2中的质粒、目的载体分别双酶切（确保该酶切位点在T载体和目标载体中不存在） 4. 电泳回收目的条带（包括目的产物和载体），进行连接 5. 转化、涂板，PCR检测是否有目的条带后，送出测序。 按这个程序走，一般都会拿到想要的结果。 |
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