| 查看: 1510 | 回复: 10 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
urbest金虫 (正式写手)
|
[求助]
求助——质粒构建问题
|
|
|
事情是这样的，我最近在构建一个质粒，将一个DNA片段使用引物扩增后，DNA和质粒均做双酶切，T4连接，转化、图板、挑克隆、摇菌、抽质粒。 我将质粒作为模板，使用引物扩增，某些质粒可以扩出目的条带，将PCR产物测序，得到正确的序列。 然后我吸取5ul阳性质粒的菌液，放入5ml LB培养基+氨苄，重新摇菌抽质粒，这次直接拿质粒测序，结果测序结果杂乱无比，全是杂峰。 然后我就用上次抽出来的测序正确的质粒重新转化、图板、挑克隆、摇菌，抽质粒，得到的质粒再次进行PCR，多次均未得到目的条带，只有几千bp那里有条带。应该不是PCR技术的问题，因为我拿第一次的质粒做了阳性对照，可以P出来。 难道拿正确的质粒重新转化，再挑克隆出来的质粒，跟老质粒会不一样吗？或者干脆就是杂菌？我加了氨苄了啊。 我现在应该怎么办？拿第一次的菌板出来重新挑克隆，还是从头开始重新构建质粒，或者有什么别的办法？ 这到底是怎么回事，真心求指导。 [ Last edited by 1949stone on 2013-6-25 at 12:25 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有78人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
关于Swern氧化遇到的问题，真心求助~~
已经有6人回复- 小弟真心求助大家帮帮忙--这个问题困扰我好久了--急急急急急！
已经有24人回复
- 真心求助offer选择问题
已经有8人回复
- 硫酸铵不溶解问题，真心求助
已经有8人回复
- 求助：重组质粒酶切问题！请大家帮我解决一下，急！
已经有7人回复
- 载体总是连不上，已经一个月了~真心求助，详细在帖子里
已经有7人回复
- 新手求助——质粒电泳条带问题
已经有15人回复
- 提不出质粒，不知道出了什么问题，求助……
已经有17人回复
- 求助：用pXMJ19构建的重组质粒在谷氨酸棒杆菌不表达，应该如何解决？
已经有6人回复
- 酵母质粒转化及提取验证问题求助
已经有12人回复
- 真心求助！本科机械想跨考功能材料类专业的问题！
已经有17人回复
- 【求助/交流】酵母PRS整合表达质粒使用的问题，我需要你的帮助，谢谢
已经有7人回复
- 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～
已经有16人回复
- 【求助/交流】质粒构建步骤，回答的好，还有几十金币追加！！！！
已经有13人回复
- 【求助/交流】请教质粒构建问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】关于质粒构建与表达的问题
已经有14人回复
zhaodahe
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 220 (大学生)
- 金币: 1796.6
- 红花: 7
- 帖子: 461
- 在线: 378.5小时
- 虫号: 552612
- 注册: 2008-04-30
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
4楼2013-06-25 21:30:18
shanqian1988
铜虫 (小有名气)
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 233.5
- 帖子: 85
- 在线: 62.4小时
- 虫号: 2465276
- 注册: 2013-05-15
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
2楼2013-06-25 12:35:04
dshlove
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 17
- 应助: 237 (大学生)
- 金币: 4764.7
- 散金: 20
- 红花: 10
- 帖子: 852
- 在线: 419.2小时
- 虫号: 1609389
- 注册: 2012-02-10
- 性别: GG
- 专业: 污染控制化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
urbest(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-25 16:58:45
urbest: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-04 12:06:02
gyesang: 回帖置顶 2013-07-30 15:50:43
感谢参与，应助指数 +1
urbest(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-25 16:58:45
urbest: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-04 12:06:02
gyesang: 回帖置顶 2013-07-30 15:50:43
|
首先一点就是，你扩增出目的条带后，送测序的不应该是PCR产物。 我建议的步骤是： 1，将DNA片段使用引物扩增后，DNA和质粒均做双酶切，T4连接，转化、涂板。 2，做菌落PCR，跑胶后，眺取有目的条带的菌落放入5ml LB培养基+氨苄，提质粒。（如果菌落太小，可以直接多挑一些单菌落，直接摇5ml LB培养基+氨苄，之后做菌液PCR） 3，如果觉得不放心，可以将提出来的质粒作为模板，做质粒PCR。 4，送测序。 |
3楼2013-06-25 14:10:35
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
urbest: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-04 12:11:13
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-04 12:18:05
gyesang: 回帖置顶 2013-07-30 15:50:37
urbest: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-04 12:11:13
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-04 12:18:05
gyesang: 回帖置顶 2013-07-30 15:50:37
|
建议： 1. PCR 扩增目的条带，连接到T载体上，转化涂板，挑单克隆，PCR检测有目的条带的单克隆挑选出来测序。 2. 用测序正确的单克隆，摇菌，提质粒 3. 将2中的质粒、目的载体分别双酶切（确保该酶切位点在T载体和目标载体中不存在） 4. 电泳回收目的条带（包括目的产物和载体），进行连接 5. 转化、涂板，PCR检测是否有目的条带后，送出测序。 按这个程序走，一般都会拿到想要的结果。 |
5楼2013-07-04 11:26:00