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小沐虫

金虫 (初入文坛)

[求助] 急求 植物CAT酶活的测定方法 ！！！

最近，在做水稻叶片CAT酶活的测定，怎么都测不出来。我是用缓冲液PBS7.0做空白调零，反应液是用0.1M的30%的过氧化氢和0.1M的PBS7.0按1:4混匀，用2.5ml的反应液加酶液50ul到于比色皿中，在240nm下进行测定，结果竟为0.000 ~~不知道为什么？急求大家指点下~~非常感谢~~·
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1楼 2013-06-20 19:11:26
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

看到楼主在其他帖子里求助CAT检测方法，可以参考这个
Misako Kato, Seki Shimizu. Chlorophyll metabolism in higher plants. VII. Chlorophyll degradation in senescing tobacco leaves; phenolic-dependent peroxidative degradation. Canadian Journal of Botany, 1987, 65(4): 729-735, 10.1139/b87-097

Catalase activity was assayed by measuring the initial rate of disappearance of H202. Three millilitres of reaction mixture contained 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.0, 2 mM H20,, and 0.1 mL enzyme extract.
The decrease in H,O, was followed as a decline in optical density at 240 nm and activity was calculated using the extinction coefficient (40.0 mM" cm-' at 240 nm) for H,O,
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3楼2013-06-20 21:50:00
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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小沐虫: 金币+6 2013-06-22 14:28:49
CAT测定是比较简单的实验，你的方法基本上没什么问题，可以从这几个方面检查：
1 分光光度计是否工作正常？楼主的检测试剂有没有问题？H2O2常温长时间放置很容易失效，0.1M H2O2最好用新鲜试剂临用前配置。
2 你添加的样品量是否足够？在酶提取时，一般可以用0.5 g植物材料在5 ml缓冲液中研磨提取。不知楼主用的是多少？为了验证提取和样品量，检测体系都正常，楼主可以试试做预实验，比如加2 ml H2O2，2 ml提取缓冲液，2 ml提取样品混合，看看240 nm下是否存在吸光度变化。
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2楼2013-06-20 21:46:53
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匿名

用户注销 (正式写手)

千年老妖
感谢参与，应助指数 +1
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4楼2013-06-21 12:57:39
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小沐虫

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-06-20 16:46:53
CAT测定是比较简单的实验，你的方法基本上没什么问题，可以从这几个方面检查：
1 分光光度计是否工作正常？楼主的检测试剂有没有问题？H2O2常温长时间放置很容易失效，0.1M H2O2最好用新鲜试剂临用前配置。
2 你添 ...

我是用0.5 g植物材料在5 ml缓冲液中研磨提取，在加入混合液与样品中发现会冒气泡，那过氧化氢应该没失效吧 还有就是有什么调零呢？是水还是缓冲液？ 我昨天试了下 发现水和我的30%的过氧化氢吸光度基本一样 若用水在240nm下调零 过氧化氢也为零 ,若用缓冲液也是零~~ 很郁闷  。。。。不知道为什么？0.1M的过氧化氢  我是用0.568ml的30%过氧化氢定容到100ml，不知道对不对? 非常谢谢了~~·
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5楼2013-06-22 14:38:36
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