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liyeer

铜虫 (小有名气)

[交流] GUS染色染不上的原因已有2人参与

我用基因枪做瞬时表达分析,一共构建了14个表达载体,报告基因是GUS,转化农杆菌之后,用质粒打基因枪,材料是温室玉米的约2.5mm的胚。第一次打枪后用GUS染液染色,都有蓝色,而且很明显。隔了三个月之后,又做一次平行(一切实验条件和用具都一样),材料还是温室玉米的约2.5mm的胚。结果染色特别浅,而且有的没染上色。请高手解答一下,这是什么原因造成的?GUS染液应该没问题的
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cjzyfx

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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3楼: Originally posted by liyeer at 2013-05-13 17:21:50
打枪的DNA是包含构建好的载体质粒的农杆菌质粒
胚还是2.5mm的胚,第一次也是这样的胚...

首先,质粒就是质粒,没有什么农杆菌,大肠杆菌质粒的
一开始我以为你是用农杆菌侵染的,所以农杆菌状态可排除,每一批胚尽管都是2.5mm的,但是可能它的状态会差别很大,还有染色液,同样的染色液,染不同批次的东西结果也会有差别,跟材料的状态,环境的变化都有关系,再者,你这属于瞬时表达,结果重复性很差,也正常
迷茫的蚊子
4楼2013-05-13 17:36:07
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cjzyfx

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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7楼: Originally posted by liyeer at 2013-05-14 08:39:35
稳定转化同时也在做。稳定表达周期太长,我们实验室是做玉米的。玉米的转化率太低,构建的载体有14个,只有一两个构建能得到转化苗(按经验),而且转化事件不足10个。这样的结果完全不够啊。
我是硕士,就想着如 ...

瞬时表达是比较快,但是也有它的弊端,要想实验结果准确,最好是做的重复数多些,以降低误差
迷茫的蚊子
8楼2013-05-14 09:04:00
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haiyanciniao

金虫 (著名写手)

自立自强自爱自律

多做几次吧,总结失败原因
自立自强自爱自律,我就是我自己的神,在我活的地方!相信自己,相信未来。加油
9楼2013-05-14 11:32:24
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cjzyfx

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
如果是这样的话估计跟胚的状态,农杆菌的状态有关系
迷茫的蚊子
2楼2013-05-13 14:49:39
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liyeer

铜虫 (小有名气)

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2楼: Originally posted by cjzyfx at 2013-05-13 14:49:39
如果是这样的话估计跟胚的状态,农杆菌的状态有关系

打枪的DNA是包含构建好的载体质粒的农杆菌质粒
胚还是2.5mm的胚,第一次也是这样的胚
3楼2013-05-13 17:21:50
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liyeer

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cjzyfx at 2013-05-13 17:36:07
首先,质粒就是质粒,没有什么农杆菌,大肠杆菌质粒的
一开始我以为你是用农杆菌侵染的,所以农杆菌状态可排除,每一批胚尽管都是2.5mm的,但是可能它的状态会差别很大,还有染色液,同样的染色液,染不同批次的东 ...

很精辟的回答!!!!!!!!受益匪浅
不好意思,再请教一下:瞬时表达应该做几个平行呢?如果平行之间差异很大,该怎么处理呢?
5楼2013-05-13 17:57:51
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cjzyfx

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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5楼: Originally posted by liyeer at 2013-05-13 17:57:51
很精辟的回答!!!!!!!!受益匪浅
不好意思,再请教一下:瞬时表达应该做几个平行呢?如果平行之间差异很大,该怎么处理呢?...

瞬时表达本身就不靠谱,何不做稳定表达
迷茫的蚊子
6楼2013-05-13 20:20:15
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liyeer

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cjzyfx at 2013-05-13 20:20:15
瞬时表达本身就不靠谱,何不做稳定表达...

稳定转化同时也在做。稳定表达周期太长,我们实验室是做玉米的。玉米的转化率太低,构建的载体有14个,只有一两个构建能得到转化苗(按经验),而且转化事件不足10个。这样的结果完全不够啊。
我是硕士,就想着如果瞬时表达结果完整的话,就用瞬时的结果毕业
可是瞬时的实验也不顺利……
7楼2013-05-14 08:39:35
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liyeer

铜虫 (小有名气)

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8楼: Originally posted by cjzyfx at 2013-05-14 09:04:00
瞬时表达是比较快,但是也有它的弊端,要想实验结果准确,最好是做的重复数多些,以降低误差...

恩,非常感谢!!!!!
10楼2013-05-15 16:56:15
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