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jingyko

铜虫 (初入文坛)

[交流] 毕赤酵母GS115胞内表达 求助

本人现在在做毕赤酵母胞内表达的实验。酵母用的gs115,载体用的是ppic3.5k。用sal1线性化,插入his4位点。
在筛选出重组子后,做诱导,破碎酵母提取蛋白后做western发现无论是加甲醇还是不加的,都有蛋白的表达,而且表达量视乎没有差异(看western的信号强度很接近)。
我怀疑是不是重组子没有筛选好,就提取了基因组做pcr验证 ,用的引物是5-AOX1和3-AOX1.然后疑惑了
没有出现表达手册上的2条带。 ppic3.5k ,和ppic3.5k-目的基因,只有200-300 的带。gs115有一天2。2k的带。但是都没有目的基因860左右的带。哪位老师能帮我分析下,200-300的带是怎么回事?怎么样能验证插入了进去(我只是利用的是营养缺陷筛选的)?

20130503pcr_副本.jpg
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