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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关细胞总RNA提取
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821078607

银虫 (小有名气)

[求助] 有关细胞总RNA提取

各位虫友：
大家好！
请教一个问题，我使用TRAZOl试剂提取细胞总RNA进行细胞因子测定,采用了多种不同的方式处理细胞，本来应该增加的细胞因子却呈现降低趋势，怀疑是RNA提取出现了问题，电泳进行了表征，很怪异。但是我将PCR之后的内标actin进行电泳，很正常，PCR是均在18左右出峰，不知道总RNA提取是否是失败，现附上电泳图请大家帮忙分析一下。

对细胞不同处理后12种样品的总RNA电泳图.jpg



12种样品actin的电泳图.png
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1楼 2013-04-23 20:49:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
821078607: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2013-04-25 20:25:09
感觉你的RNA质量不行。电泳的上样量是多少？
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2楼2013-04-24 04:45:33
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jwucn

至尊木虫 (文坛精英)
..........................帮您顶一个...................................
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3楼2013-04-24 07:37:30
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
821078607: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-04-24 17:22:19
gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-04-24 17:28:56
821078607: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2013-04-25 20:24:50
你是怎么检测细胞因子的表达呢？后续做qRT-PCR么？虽然ＲＮＡ有些降解，但我觉得内参P出来挺好的，所以这个RNA也可以用来做后续的实验。。。因为它并不是完全降解了。。。
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keepon
4楼2013-04-24 10:00:09
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麦戈桑默

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-04-24 17:29:21
我提取的也总是降解，所用的器皿也用DEPC水泡过，过程如下：收菌以后用生工家的trizol悬浮菌体，液氮研磨，每1mltrizol 0.2ml氯仿的量加入氯仿，手摇混匀2min,在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g4℃离心10分钟。取上层水相置于新EP管中，加等体积l异丙醇。放置20分钟，12000g4℃离心10分钟。        弃上清，按照每管加1ml 75%乙醇进行洗涤，12000g4℃离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
用DEPC熏蒸过的水溶解RNA沉淀。

我的电泳槽也用DEPC水泡过
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5楼2013-04-24 10:40:38
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821078607

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-24 04:45:33
感觉你的RNA质量不行。电泳的上样量是多少？

电泳用的RNA浓度很大，用了7.5微升 不过配置电泳液直接用的二次蒸馏水 电泳40分钟左右  不知道这个会不会对RNA有影响
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6楼2013-04-24 17:20:09
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821078607

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-04-24 10:00:09
你是怎么检测细胞因子的表达呢？后续做qRT-PCR么？虽然ＲＮＡ有些降解，但我觉得内参P出来挺好的，所以这个RNA也可以用来做后续的实验。。。因为它并不是完全降解了。。。

测定细胞因子是用的半定量PCR
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7楼2013-04-24 17:21:48
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821078607

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 麦戈桑默 at 2013-04-24 10:40:38
我提取的也总是降解，所用的器皿也用DEPC水泡过，过程如下：收菌以后用生工家的trizol悬浮菌体，液氮研磨，每1mltrizol 0.2ml氯仿的量加入氯仿，手摇混匀2min,在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g4℃离心 ...

我电泳时没有用DEPC水 电泳条件为100V 40min 这样会不会影响RNA电泳 RNA会不会在电泳的时候降解
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8楼2013-04-24 17:26:28
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
821078607: 金币+5, 谢谢 2013-04-25 20:24:23
提的好的RNA应该是这样子的，请见贴子http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5797357&authorid=849017的回复

你110V跑40min，太久了，你可以160V 跑10min，RNA不宜跑时间太长
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
9楼2013-04-24 17:32:17
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raindick1231

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
821078607(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励新虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-26 19:34:09
821078607: 金币+6, ★★★很有帮助, 非常感谢 2013-04-28 10:17:30
那个我做的植物 用的也是TRIZOL，原理一样。我的经验是在取上清之前的一切步骤 “不需要” 注意RNase污染，但是样品不能过多（很重要！！！），而且要注意不要交叉污染。
        取上清之后要小心，乙醇、异丙醇之类的不用多说降解了就换吧，配75乙醇的瓶子用锡箔纸封口多烘几个，枪头、EP管之类的耗材。。。我用的是包装上注明了RNase-free的，所以从来不用DEPC处理的，也不灭菌。。。成本也不高
        唯一我认为比较麻烦的就是水了。。。。所以RNA很简单的 我一般一口气提30个（离心机所限）希望对你有用，祝好运！
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10楼2013-04-24 20:48:33
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