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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助microRNA real time pcr结果分析
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momo2111

木虫 (小有名气)

[求助] 求助microRNA real time pcr结果分析

新人刚入手microRNA，第一次做real time pcr只做了一个样品U6的三个复孔，结果出来很奇怪，溶解曲线有双峰，而且前面的峰很高，扩增曲线也没有起来，由于刚接触，请各位大侠帮忙分析一下原因，十分感谢！

Melt Curve2.jpg



Amplification Plot2.jpg
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1楼 2013-04-23 11:43:29
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momo2111

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-23 14:22:23
都没有扩增曲线，分析溶解曲线没有意义，
1. 没有加模板，无模板扩增？
2. 仪器没有坏吧
3. RNA提的不好？没有提取到RNA，或者RNA降解了？抑或没有逆转录好？
4. 引物设计的不好？

RNA提完之后A260/A280=1.96，而且马上就进行逆转录的，而且仪器没有坏呢，现在只能先再试一次，看看结果。不知道cDNA的量 和引物浓度有没有关系，我哦想问一下，我之前问试剂公司他们告诉我引物终浓度是500nM，这引物终浓度指的是上游引物和下游引物分别是500nM，还是两个引物加起来500nM?
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3楼2013-04-24 18:35:04
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gyesang

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【答案】应助回帖

★
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momo2111(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-24 22:29:45
都没有扩增曲线，分析溶解曲线没有意义，
1. 没有加模板，无模板扩增？
2. 仪器没有坏吧
3. RNA提的不好？没有提取到RNA，或者RNA降解了？抑或没有逆转录好？
4. 引物设计的不好？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-04-23 14:22:23
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by momo2111 at 2013-04-24 18:35:04
RNA提完之后A260/A280=1.96，而且马上就进行逆转录的，而且仪器没有坏呢，现在只能先再试一次，看看结果。不知道cDNA的量 和引物浓度有没有关系，我哦想问一下，我之前问试剂公司他们告诉我引物终浓度是500nM，这引 ...

这引物终浓度指的是上游引物和下游引物分别是500nM，分别
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-04-24 19:51:03
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momo2111

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-24 19:51:03
这引物终浓度指的是上游引物和下游引物分别是500nM，分别...

那应该就没错啊，下次再换个样品试试。扩增曲线没有，但结果里面CT值却是有的，13左右
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5楼2013-04-24 22:28:39
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