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momo2111

木虫 (小有名气)

[求助] 求助microRNA real time pcr结果分析

新人刚入手microRNA,第一次做real time pcr只做了一个样品U6的三个复孔,结果出来很奇怪,溶解曲线有双峰,而且前面的峰很高,扩增曲线也没有起来,由于刚接触,请各位大侠帮忙分析一下原因,十分感谢!

Melt Curve2.jpg



Amplification Plot2.jpg
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gyesang

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【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
momo2111(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流,期待你的精彩1 2013-04-24 22:29:45
都没有扩增曲线,分析溶解曲线没有意义,
1. 没有加模板,无模板扩增?
2. 仪器没有坏吧
3. RNA提的不好?没有提取到RNA,或者RNA降解了?抑或没有逆转录好?
4. 引物设计的不好?
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-04-23 14:22:23
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momo2111

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-23 14:22:23
都没有扩增曲线,分析溶解曲线没有意义,
1. 没有加模板,无模板扩增?
2. 仪器没有坏吧
3. RNA提的不好?没有提取到RNA,或者RNA降解了?抑或没有逆转录好?
4. 引物设计的不好?

RNA提完之后A260/A280=1.96,而且马上就进行逆转录的,而且仪器没有坏呢,现在只能先再试一次,看看结果。不知道cDNA的量 和引物浓度有没有关系,我哦想问一下,我之前问试剂公司他们告诉我引物终浓度是500nM,这引物终浓度指的是上游引物和下游引物分别是500nM,还是两个引物加起来500nM?
3楼2013-04-24 18:35:04
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by momo2111 at 2013-04-24 18:35:04
RNA提完之后A260/A280=1.96,而且马上就进行逆转录的,而且仪器没有坏呢,现在只能先再试一次,看看结果。不知道cDNA的量 和引物浓度有没有关系,我哦想问一下,我之前问试剂公司他们告诉我引物终浓度是500nM,这引 ...

这引物终浓度指的是上游引物和下游引物分别是500nM,分别
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-04-24 19:51:03
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momo2111

木虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-24 19:51:03
这引物终浓度指的是上游引物和下游引物分别是500nM,分别...

那应该就没错啊,下次再换个样品试试。扩增曲线没有,但结果里面CT值却是有的,13左右
5楼2013-04-24 22:28:39
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