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zhangjie801284木虫 (正式写手)
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ＤＮＡ提取过程能否满足ＰＣＲ的参考1 、CTAB提取液:分别配制2%的(W/V) CTAB,其他成分相同分别为100mmol/ L Tris-HCl(pH=8. 0)，5Ommol/L EDTA pH8.0,1400 mmol/ L NaCl。1%-疏基乙醇，2%-PVP. 2 、CTAB提取缓冲液:100 mL含2gCTAB, 10 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH 8. 0)，0.74gEDTA, 8.18 g N aCl, 0.2 mL巯基乙醇。DNA提取液:二氯甲烷与异戊醇的体积比为24：1 3、改良后的CTAB法具体提取步骤如 ( 1)取新鲜叶片1g放入己冷冻的研钵中，加入不溶性的pvp0.2g在液氮中迅速侧h磨成粉末;然后将粉末放入含650 u高盆提取缓冲液1.5ml加入离心管中,加入80u1巯基乙醇，混匀，65℃水浴的75 min其间混匀 2- 3次，取出样品，冷却至室温;(2)加入650u1氯仿/异戊醇(24: 1), 50 u1饱和酚，震荡混匀，12000 r/min离心lOmin(3)取上清液，移至另一1.5 ml离心管中，再加入700 u 1氯仿屏戊醇( 24: 1),震荡混匀，12 000 r/min离心10 min(4)取上清液，移至另一15ml,离心管中，加入5mol/LNaC1200u1、加入600 u 1冰冻无水乙醇，充分混匀，静置，-20℃沉淀凝聚2h 10 000 r/min,离心lOmin (5)弃上清，加入75%乙醇洗涤2- 3次，最后将沉淀置于40℃烘箱中烘干，加入100ulTE buffer中溶解沉淀，待完全溶解后短暂离心。 4、提取缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl(PH=8.0),20 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1.4 mo1/L NaCL 质量分数20%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，质量分数2%巯基乙醇.DNA缓冲液:50 mmol/L Tri*-HC1(PH =8.0), 10 mmol/L EDTA. 5、行充分研磨，研磨后粉末迅速放入65℃预热的1mL2*CTAB( 2%CTAB; 1.4mol/LNaCl(pH8.0)0.02mo1/LEDTA(pH8.0.);0.lmol/LTris-HCl(PH8.0);0.06mo1/L Vitamin C; 4%琉基乙醇 (用前加))提取缓冲液中 6、 CTAB法提取液:100 mmol/lTris-HC1 (pH 8.0)1.4mol/lNaC1,20 mmol/lEDTA (pII 8.0), 2% CTAB ,2% PV P, 2%琉基乙醇。 6、 7、 8、提取缓冲液2*CTAB:2% CTAB,l00mM Tris-Cl(PH8.0) , 20mM EDTA(PH 8.0),1.4M NaCl，2% Na2Co3 2%PVP,3% 巯基乙醇(使用前加入) 9、 9、 |
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DNA提取方法的探讨
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CTAB法： DNA提取Buffer的配制：3% CTAB (W/V)，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，0.2% 巯基乙醇。 1） 取0.1克左右新鲜叶片，放入1.5ml离心管中，加入液氮，将叶片研磨成粉末。待离心管中液氮挥发完全后，迅速加入 600μl CTAB DNA提取Buffer，充分混匀后，于室温或65℃放置30-60min，每隔10min颠倒一次； 2) 加入1倍体积氯仿/异戊醇，充分混匀，12,000rpm室温离心15min，取上清； 3) 加入1倍体积异丙醇，晃动离心管，使异丙醇与上清液充分混匀，可见白色絮状DNA析出，12,000rpm室温离心5min，去上清， 加入 1ml 70%乙醇，于室温放置30min； 4) 弃上清液，让沉淀在超静台上吹干或用真空泵抽干，加入100μl SDW，使沉淀完全溶解: 5） 取1μl DNA溶液在0.8%琼脂糖凝胶上检查DNA的质量并通过浓度梯度定量； 6） 将其余DNA样品保存在-20℃备用。 酚－氯仿提取法 1. 取液氮冷冻的叶片2-3片， 在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。 2. 将粉末放入到1.5 ml离心管中，然后加入缓冲液“S”750ul, 充分混匀。 3. 将离心管置于65℃水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。 4. 取出离心管, 每管加入等体积的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul，混匀后离心，10000rpm, 10分钟。 5. 上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，10000rpm, 6分钟。 6. 将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA,并用70％乙醇冲洗2次。 7. 勾出的DNA，真空干燥后将其溶于500ul 1x TE中。 8. 加入3ul RNA 酶溶液，37℃保温1 小时。 9. 加入等体积的酚-氯仿溶液, 轻轻混匀后, 10000rpm离心6分钟。 10. 取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000rpm离心6分钟。 11. 取上清液，入1/10体积3M醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇（或95％乙醇）。轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA, 用70％乙醇冲洗2次后，真空干燥。依所提DNA量加入20-50ul的1x TE溶解DNA。 12. 测定DNA 的浓度，取少量样品跑电泳, Agarose 胶的浓度为0.8%。 13. 样品在4℃下保存备用 [ Last edited by shanzhuyu on 2007-9-17 at 19:51 ] |
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4楼2011-03-25 21:04:30
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