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gissingtan

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[求助] 求助师兄师姐~有关于巢式PCR的问题~~help

最近在做巢式PCR，请问有经验的师兄师姐，你们第一次PCR的产物需要做什么处理才作为第二次PCR的模板？
我听师姐说直接切胶，放-20℃过夜，12000rpm离心10min，取上清液做模板，不知是否合理，我自己尝试了一下，跑胶检测没有条带。

我想请教：
1、第一次PCR产物是怎么处理，再作为第二次PCR的模板
2、我做的方法是否正确，如果正确，为什么检测没有条带
谢谢大家了

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1楼2013-04-07 15:52:54

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myprayer

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【答案】应助回帖

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gissingtan: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-04-10 17:43:08
gyesang: MolEPI+1, 5 2013-04-10 18:44:33

1)nested-PCR,主要解决的问题有两个方面：一是利用4条引物（2个内引物，2个外引物）增加了PCR的特异性，二是第2次扩增以第一次PCR产物为模板，相对于基因组模板而言，更加简单化，有利于引物和模板的有效复性，提高扩增效率。

2）如果要提高扩增效果，具备回收的条件的话，回收后继续第二次PCR是没有问题的。如果不具备回收条件，不回收直接稀释后进行二次PCR也可，因为内引物同样具有相当的特异性，如果设计合理，第一次非特异性的扩增产物为模板，不能和第二对引物有效结合，这样的非特异产物的模板不能在第二次扩增中产生目的条带。这也正是NESTED PCR的优点。

3）其他需要强调的，我根据我的经验，主要是控制好引物的比例，也就是说，如果第一次PCR的引物如果过量的话，剩余引物二次PCR的时候同样能有一定的产量，这相对于第二次PCR而言就是非特异性的产物。解决的方法很简单，第一次PCR时，引物尽量摸索最低的加入量，增加循环次数，尽量消耗体系中残余的引物。二次PCR时，增加内引物的量，二者还是有一定竞争关系，道理不言而喻了。
巢式PCR的定义：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。
巢式PCR反应：巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片断。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片断。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。从而提高反应的特异性
巢式PCR的实验步骤：第一步：目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片断（图中未显示可能的多种产物）。
第二步：使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。
由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。
巢式PCR的应用一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等
在RACE(rapid-amplification of cDNA ends)中，也利用巢式PCR增加特异性
在Illumina公司平台的第二代高通量测序中，也应用类似巢式PCR的原理，进行目的片段的扩增。
首先在目的片段通过TA克隆，引入一个片段，然后在特定的一个Flow Cell固定大量的特异探针，通过PCR反应的特异性，扩增目的片段，然后继续应用于下一步测序
巢式PCR，可以在10的六次方基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，也不像二次PCR容易产生成片的产物，是效果最好的PCR，扩增质量最高的PCR。