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hylee103

金虫 (正式写手)

[求助] LAMP相关问题求助 已有2人参与

最近在做病毒的lamp检测，原模板浓度为0.2ug/ul,将模板10倍稀释，稀释到10 -21时，还可以检测到，是不是出现假阳性了？该怎么避免假阳性现象呢？求大家多多指导！
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1楼 2013-03-14 20:20:30
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回帖置顶 ( 共有1个 )

soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

★ ★
hylee103(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-01 18:50:15
gyesang: 回帖置顶 2013-05-03 00:26:05
假阳性可以通过NTC（No Template Control）做测试
一般的LAMP实验能做到10-100copies/reaction,,,运气好的时候设计的引物能到个位数
不过个位数copy的检出需要重复，并计算95%检出率的置信区间
总的来说，LAMP极其容易出现假阳性，所以一旦出现，必须更换引物、试剂，引物尤其是FIP、BIP最好是HPLC纯化的
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6楼2013-04-30 23:20:48
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
★ ★
hylee103(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-05-03 00:29:00
引用回帖:
11楼: Originally posted by gengning0427 at 2013-05-02 16:29:58
大谢阁下！！我刚P了 ，按照你上面说的 四个配对 都做了。都能P出来 不过有BIP和FIP的都有引物二聚体~~~这个影响不算太大吧...

LAMP的FIP、BIP极易出现引物二聚体，这个正常
都能P出来，那你得看看是不是以下问题：
1.FIP、BIP中的F1c、B1c那个方向对不对---如果是primer explorer设计的话不会错，手工设计的时候有时候会粗心
2.有没有在反应中使用loop引物---有时候设计不理想，灵敏度会很低，这时候往往需要通过延长反应时间或者添加loop引物
3.反应体系是自配还是试剂盒，如果自配的不好就可以试试试剂盒，国产的比鬼子的便宜不少
4.以上都不行，那啥你就换一套吧，这个真没辙了
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dh_369075881
13楼2013-05-03 00:15:00
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

★ ★
hylee103(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-05-01 18:50:34
引用回帖:
3楼: Originally posted by gengning0427 at 2013-04-28 15:27:08
我是来求助的~~~我的LAMP为什么总也P不出来 去网上找的各种资料 是不是有什么地方不对，LZ可以指教下么？

很简单，用你设计的外引物F3、B3直接去做PCR or RT-PCR
灵敏度虽然不一定比得上LAMP，但是相差也不会太多
同样道理，内引物FIP、BIP也可以类似测试---如果F2-B2之间间隔太小，扩增产物不好与引物二聚体区分，可以用FIP和B3、BIP和F3来分别做个测试
也就是半天时间，测试完了就都知道了
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7楼2013-04-30 23:25:16
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119904386

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
hylee103(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-29 14:01:05
lamp极易假阳性，除了注意操作外，只能换用品、换试剂、换枪、换房间了
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2楼2013-03-19 07:53:42
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gengning0427

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by soarrow at 2013-05-02 00:55:06
当然是Taq酶，前面已经说过了是去做PCR验证
比较起码内外4条引物都同时使用才能使用Bst来扩增
一对引物+Bst是扩增不出来东西的...

而且我用的退火温度都是55℃，是不是把LAMP的温度也改到55℃合适些？
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戒掉安逸 多逼逼自己
12楼2013-05-02 16:30:42
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普通回帖

gengning0427

铜虫 (小有名气)
我是来求助的~~~我的LAMP为什么总也P不出来 去网上找的各种资料 是不是有什么地方不对，LZ可以指教下么？
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戒掉安逸 多逼逼自己
3楼2013-04-28 15:27:08
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hylee103

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gengning0427 at 2013-04-28 15:27:08
我是来求助的~~~我的LAMP为什么总也P不出来 去网上找的各种资料 是不是有什么地方不对，LZ可以指教下么？

你确定你的引物是否好用了吗？
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4楼2013-04-29 12:08:27
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gengning0427

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hylee103 at 2013-04-29 12:08:27
你确定你的引物是否好用了吗？...

怎么才能确定？有办法吗？我也是不太确定引物能不能行
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戒掉安逸 多逼逼自己
5楼2013-04-30 11:54:26
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gengning0427

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by soarrow at 2013-04-30 23:25:16
很简单，用你设计的外引物F3、B3直接去做PCR or RT-PCR
灵敏度虽然不一定比得上LAMP，但是相差也不会太多
同样道理，内引物FIP、BIP也可以类似测试---如果F2-B2之间间隔太小，扩增产物不好与引物二聚体区分，可以 ...

普通使用Taq酶的PCR测试吗？还是用等温的方法，用Bst酶？
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戒掉安逸 多逼逼自己
8楼2013-05-01 18:24:31
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
★ ★
hylee103(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-05-02 01:12:12
hylee103(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-05-03 00:30:35
引用回帖:
8楼: Originally posted by gengning0427 at 2013-05-01 18:24:31
普通使用Taq酶的PCR测试吗？还是用等温的方法，用Bst酶？...

当然是Taq酶，前面已经说过了是去做PCR验证
比较起码内外4条引物都同时使用才能使用Bst来扩增
一对引物+Bst是扩增不出来东西的
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9楼2013-05-02 00:55:06
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nmhsd

木虫 (正式写手)
都到10 -21还能检测出来？楼主将其每反应体系中的模板浓度折算为拷贝数后是多少？LAMP这种技术太不靠谱了吧，这么容易出现假阳性，除了检疫用，可能别无其他用途了吧。
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10楼2013-05-02 10:30:26
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