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养活它

新虫 (初入文坛)

[求助] 有关LAMP的交流。。。已有1人参与

LAMP反应体系中buffer一般加多少？
      dNTP要求25ul体系中终浓度是2.5mmol/l，可是我现在买回来的dNTP浓度就是这么多，该怎么取？
      Bst酶现在是8000U/ml，可是文献上要求是8U，两者单位不统一啊。。。怎么办?
           还有模板最终是用多少TE溶解的（其中加Rnase吗）？
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1楼2012-12-06 16:07:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

TE中EDTA对酶有抑制，但是buffer里面有足够高的Mg离子来缓和这种抑制吧，DNA如果不放在TE里，降解会很快的，如果样品需要反复使用，建议高浓度保存在TE中，使用前用灭菌纯水稀释。
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行至水穷处，坐看云起时
7楼2012-12-10 16:54:00
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songxuebai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

LAMP实验，有时候能扩出来、有时候没有。我觉得还是体系不太佳，引物浓度及比例比较重要，长短引物浓度比从1：4到1:8都做一下，模板1--2ul，dNTP10mmol/L的一般加2.5ul，Mg2+25mmol/L可以加2--4ul。一般在反应体系，加甜菜碱终浓度1M。还有在其他试剂都加好后，95℃温育5min，冷却后再加BstDNA酶，再反应。反应温度可以在60-65℃都做一下。希望对你有帮助。
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8楼2012-12-10 19:35:59
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songxuebai

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 养活它 at 2012-12-10 16:51:00
非常感谢您的帮助，我是初次接触LAMP实验，有时候可以做成功，看见的白色沉淀很多，但是，有时候就看不见了，不知道是什么原因，请您指点。我引物终浓度依次是F3/B30.4um/l  FIP/BIP 2.4um/l  LF/LB1.2um/l   dNTP ...

LAMP实验，有时候能扩出来、有时候没有。我觉得还是体系不太佳，引物浓度及比例比较重要，长短引物浓度比从1：4到1:8都做一下，模板1--2ul，dNTP10mmol/L的一般加2.5ul，Mg2+25mmol/L可以加2--4ul。一般在反应体系，加甜菜碱终浓度1M。还有在其他试剂都加好后，95℃温育5min，冷却后再加BstDNA酶，再反应。反应温度可以在60-65℃都做一下。希望对你有帮助。
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9楼2012-12-10 19:36:26
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zdfang83

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
buffer这个应该根据浓度确定就行了吧，公司有卖高浓度dNTP的，我记得好像是10的，你找目录看一下就行了，单卖的；酶的问题更简单，肯定是要稀释的啊，需要8U，你加8微升不就正好吗
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2楼2012-12-06 18:03:58
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zdfang83

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

忘了模板的问题，我们实验室一般是用无菌去离子水溶解的，TE中有的东西对酶不好，平时都是用水溶解的。
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3楼2012-12-06 18:05:10
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songxuebai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我做了很多次LAMP实验，一般10xbuffer加2.5ul就可以了，8000U/ml的BstDNA酶一般加1ul，引物浓度一般FIP/BIP:F3/B3=8：1，TE和超纯水都可以的。希望对你有帮助。
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养活它
4楼2012-12-07 19:55:35
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养活它

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by songxuebai at 2012-12-07 19:55:35
我做了很多次LAMP实验，一般10xbuffer加2.5ul就可以了，8000U/ml的BstDNA酶一般加1ul，引物浓度一般FIP/BIP:F3/B3=8：1，TE和超纯水都可以的。希望对你有帮助。

非常感谢您的帮助，我是初次接触LAMP实验，有时候可以做成功，看见的白色沉淀很多，但是，有时候就看不见了，不知道是什么原因，请您指点。我引物终浓度依次是F3/B30.4um/l  FIP/BIP 2.4um/l  LF/LB1.2um/l   dNTP2.8mmol/l   模板 2ul    Bst 酶 1ul  buffer 4ul，您看看有啥问题吗？
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5楼2012-12-10 16:51:00
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养活它

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zdfang83 at 2012-12-06 18:05:10
忘了模板的问题，我们实验室一般是用无菌去离子水溶解的，TE中有的东西对酶不好，平时都是用水溶解的。

谢谢，以后注意了。
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6楼2012-12-10 16:51:29
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养活它

新虫 (初入文坛)
谢谢您，我再试试。

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10楼2012-12-10 20:27:16
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