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gengning0427

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by soarrow at 2013-05-02 00:55:06
当然是Taq酶，前面已经说过了是去做PCR验证
比较起码内外4条引物都同时使用才能使用Bst来扩增
一对引物+Bst是扩增不出来东西的...

大谢阁下！！我刚P了 ，按照你上面说的 四个配对 都做了。都能P出来 不过有BIP和FIP的都有引物二聚体~~~这个影响不算太大吧
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戒掉安逸 多逼逼自己
11楼2013-05-02 16:29:58
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gengning0427

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by soarrow at 2013-05-02 00:55:06
当然是Taq酶，前面已经说过了是去做PCR验证
比较起码内外4条引物都同时使用才能使用Bst来扩增
一对引物+Bst是扩增不出来东西的...

而且我用的退火温度都是55℃，是不是把LAMP的温度也改到55℃合适些？
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戒掉安逸 多逼逼自己
12楼2013-05-02 16:30:42
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
★ ★
hylee103(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-05-03 00:29:00
引用回帖:
11楼: Originally posted by gengning0427 at 2013-05-02 16:29:58
大谢阁下！！我刚P了 ，按照你上面说的 四个配对 都做了。都能P出来 不过有BIP和FIP的都有引物二聚体~~~这个影响不算太大吧...

LAMP的FIP、BIP极易出现引物二聚体，这个正常
都能P出来，那你得看看是不是以下问题：
1.FIP、BIP中的F1c、B1c那个方向对不对---如果是primer explorer设计的话不会错，手工设计的时候有时候会粗心
2.有没有在反应中使用loop引物---有时候设计不理想，灵敏度会很低，这时候往往需要通过延长反应时间或者添加loop引物
3.反应体系是自配还是试剂盒，如果自配的不好就可以试试试剂盒，国产的比鬼子的便宜不少
4.以上都不行，那啥你就换一套吧，这个真没辙了
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dh_369075881
13楼2013-05-03 00:15:00
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
★ ★
hylee103(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-05-03 00:29:12
引用回帖:
12楼: Originally posted by gengning0427 at 2013-05-02 16:30:42
而且我用的退火温度都是55℃，是不是把LAMP的温度也改到55℃合适些？...

不合适
1.Bst酶活性最佳是65度，55度时候活性低了很多
2.温度低，引物结合不理想，反应自然就更慢了
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14楼2013-05-03 00:16:52
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gengning0427

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by soarrow at 2013-05-03 00:15:00
LAMP的FIP、BIP极易出现引物二聚体，这个正常
都能P出来，那你得看看是不是以下问题：
1.FIP、BIP中的F1c、B1c那个方向对不对---如果是primer explorer设计的话不会错，手工设计的时候有时候会粗心
2.有没有在反 ...

对了~~FIP  分别是由F2和F1C组成的 他们之间需要连接TTTT吗？或者直接连接一起就行呢？
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戒掉安逸 多逼逼自己
15楼2013-05-03 09:28:19
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晴晴12352

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by soarrow at 2013-05-03 00:16:52
不合适
1.Bst酶活性最佳是65度，55度时候活性低了很多
2.温度低，引物结合不理想，反应自然就更慢了...

亲，想请教个问题，LAMP老出现假阳性怎么办呢？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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16楼2014-08-02 16:28:50
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by 晴晴12352 at 2014-08-02 16:28:50
亲，想请教个问题，LAMP老出现假阳性怎么办呢？
...

1. 找个干净的房间or超净台or生物安全柜
2. 未开封的引物和无核酶水，配制引物
3. 未开封的Reaction Mix和Bst酶，RT-LAMP的话还有AMV酶，配制反应体系
4. 做NTC(No Template Control)，用无核酶水充当模板，3个一组
5. 等温反应，我一般会把NTC的反应时间设置为120分钟，方便观察是否有非特异反应以及非特异反应的出峰时间
6. 如果非特异反应没有或者出峰时间在60分钟之后，那这套引物有戏；如果非特异出峰很快，那就重新设计引物吧
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17楼2014-08-04 21:56:22
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晴晴12352

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by soarrow at 2014-08-04 21:56:22
1. 找个干净的房间or超净台or生物安全柜
2. 未开封的引物和无核酶水，配制引物
3. 未开封的Reaction Mix和Bst酶，RT-LAMP的话还有AMV酶，配制反应体系
4. 做NTC(No Template Control)，用无核酶水充当模板，3个 ...

请问什么是出峰时间呢？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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18楼2014-08-14 15:07:23
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
引用回帖:
18楼: Originally posted by 晴晴12352 at 2014-08-14 15:07:23
请问什么是出峰时间呢？
...

实时扩增曲线，浊度值或者荧光值开始迅速上升的时间，，，跟realtime PCR类似的意思
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19楼2014-08-14 15:26:35
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郑传益

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by soarrow at 2014-08-04 21:56:22
1. 找个干净的房间or超净台or生物安全柜
2. 未开封的引物和无核酶水，配制引物
3. 未开封的Reaction Mix和Bst酶，RT-LAMP的话还有AMV酶，配制反应体系
4. 做NTC(No Template Control)，用无核酶水充当模板，3个 ...

请问你是怎么监测出风时间的呢？
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满足等于堕落
20楼2015-04-25 02:15:09
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