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liangjuan2007

铜虫 (小有名气)

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[求助] 双抗体夹心ELISA的梯度浓度标准品实验结果确无梯度变化，真心求大家帮忙分析原因！

最近做双抗体夹心ELISA，一抗二抗用的都是进口的，之前做WB试验的，标准品是sigma公司的冻干粉，买回来自己配的不同的梯度浓度，最后标准品的实验结果却没有梯度变化，数据几乎完全一样，到底是为什么啊！
我配置的标准品的浓度如下：(U/L) 200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、
相应的OD值结果：2.564、2.617、2.719、2.657、2.712、2.835、2.646、
空白孔的值也大的吓人，为:2.697.
做了好多次结果都是这样，一抗稀释度做过1:2000、1:4000、1:6000，二抗做过1:4000、1:8000、1:16000的，完全没有梯度，这是为什么啊为什么啊？
我具体的实验步骤如下：
(1)包被：用包被缓冲液将一抗稀释成一定浓度。在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
(2)封闭：封闭液（5%的脱脂奶粉）每孔0.2ml，37℃，2h后洗涤。（尝试过封闭和不封闭的，结果没有差别）
(3)加样：加一定浓度稀释（封闭液稀释）的标准品溶液(同时做空白对照)0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，37℃， 1 hr。用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
(4)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（封闭液稀释）0.1ml。37℃，0.5 - 1 hr，用洗涤缓冲液洗板6 次，每次3 min。（怕洗不干净，加倍次数，据说这步的洗涤很重要！）
(5)加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。（TMB用的是生工的粉末，然后自己配的）
(6)终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05 mL。
(7)结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450 nm读数。
都快抑郁了，跪求各位前辈给点意见吧！

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1楼2013-02-25 14:50:53

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烟大考研

金虫 (正式写手)

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问题解决了没有？楼主把一抗和二抗分别是什么说一下吧，有时候一点粗心，把一抗和二抗选择错误也会导致这样的结果
楼主的显色时间貌似有点长，显色时间过长的话也可能把梯度给弄没了，我之前显色不超过5min，有时候凭眼睛也能大概判定显色终点的
最后显色时呈现暗绿色，这个就是很明显的显色显过了。。。
不过你的空白呈现那么高的吸收，就是不正常，建议把一抗和二抗发上来，让大家分析一下

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心信其可行，则移山填海之难，终有成功之日；心信其不可行，则反掌折枝之易，亦无收效之期

13楼2013-04-07 18:19:12

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