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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 咨询个问题，有做过接合转移的高人吗
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chuxuan

铜虫 (正式写手)

[求助] 咨询个问题，有做过接合转移的高人吗

我构建了一个载体（载体含克隆了菌的两个同源臂，要插入的基因在两个同源臂之间）
用这个载体与菌进行接合转移（进行同源重组）
可是一直没办法成功。
我不知道是什么原因。。。。
有没有高人给点意见啊
(做接合的菌不是原始菌株，而是经过改造的工业菌株。。以前有师姐用原始菌株做过，可以的。。我现在就是想将这个高产的工业菌株，在用构建的载体来试下，看能否提高产量。。。。。可是就是没成功）
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1楼 2013-02-21 16:27:00
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monson2008

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体是什么性质的?自杀质粒还是稳定遗传的?
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2楼2013-02-22 11:12:37
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你构建的质粒，有抗生素标记吗？
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3楼2013-02-22 12:15:26
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chuxuan

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by monson2008 at 2013-02-22 11:12:37
载体是什么性质的?自杀质粒还是稳定遗传的?

是自杀性载体。。。。有时候做接合之后，有长出来接合子。。但怎么长的是大肠。。。。
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4楼2013-02-22 12:30:08
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chuxuan

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biosci at 2013-02-22 12:15:26
你构建的质粒，有抗生素标记吗？

有抗生素标记的。
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5楼2013-02-22 12:30:22
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
大肠杆菌和放线菌的接合转移吧。注意别用错抗生素。
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6楼2013-02-22 20:09:21
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chuxuan

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-02-22 20:09:21
大肠杆菌和放线菌的接合转移吧。注意别用错抗生素。

别用错抗生素，大侠指教下。。。。抗生素用什么才是正确的。。
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7楼2013-02-22 20:48:59
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by chuxuan at 2013-02-22 20:48:59
别用错抗生素，大侠指教下。。。。抗生素用什么才是正确的。。...

你最好有个详细的实验步骤，这样方便大家帮你分析，有时一个实验细节决定了试验的成败。
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8楼2013-02-22 21:08:52
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chuxuan

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-02-22 21:08:52
你最好有个详细的实验步骤，这样方便大家帮你分析，有时一个实验细节决定了试验的成败。...

我做接合的时候，步骤差不多是这样的
1、两菌养到对数期
2、各取3ML到EP管，离心
3、用LB洗两次
4、洗完之后就用LB悬浮
5、供体菌与受体菌差不多1:1进行混合
6、涂布到LB平板预培养6个小时
7、培养完之后，再将平板上长得菌用LB洗下来，涂布到菌特定的培养平板上。。这样就完了。。。。
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9楼2013-02-22 21:14:23
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by chuxuan at 2013-02-22 21:14:23
我做接合的时候，步骤差不多是这样的
1、两菌养到对数期
2、各取3ML到EP管，离心
3、用LB洗两次
4、洗完之后就用LB悬浮
5、供体菌与受体菌差不多1:1进行混合
6、涂布到LB平板预培养6个小时
7、培养完之后， ...

不是标准的链霉菌接合转移方法，如果是链霉菌，建议参考PCR targeting protocol.
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10楼2013-02-22 23:19:48
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