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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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chuxuan

铜虫 (正式写手)

[求助] 咨询个问题,有做过接合转移的高人吗

我构建了一个载体(载体含克隆了菌的两个同源臂,要插入的基因在两个同源臂之间)
用这个载体与菌进行接合转移(进行同源重组)
可是一直没办法成功。
我不知道是什么原因。。。。
有没有高人给点意见啊
(做接合的菌不是原始菌株,而是经过改造的工业菌株。。以前有师姐用原始菌株做过,可以的。。我现在就是想将这个高产的工业菌株,在用构建的载体来试下,看能否提高产量。。。。。可是就是没成功)
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monson2008

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
载体是什么性质的?自杀质粒还是稳定遗传的?
2楼2013-02-22 11:12:37
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你构建的质粒,有抗生素标记吗?
3楼2013-02-22 12:15:26
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chuxuan

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by monson2008 at 2013-02-22 11:12:37
载体是什么性质的?自杀质粒还是稳定遗传的?

是自杀性载体。。。。有时候做接合之后,有长出来接合子。。但怎么长的是大肠。。。。
4楼2013-02-22 12:30:08
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chuxuan

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by biosci at 2013-02-22 12:15:26
你构建的质粒,有抗生素标记吗?

有抗生素标记的。
5楼2013-02-22 12:30:22
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
大肠杆菌和放线菌的接合转移吧。注意别用错抗生素。
6楼2013-02-22 20:09:21
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chuxuan

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-02-22 20:09:21
大肠杆菌和放线菌的接合转移吧。注意别用错抗生素。

别用错抗生素,大侠指教下。。。。抗生素用什么才是正确的。。
7楼2013-02-22 20:48:59
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by chuxuan at 2013-02-22 20:48:59
别用错抗生素,大侠指教下。。。。抗生素用什么才是正确的。。...

你最好有个详细的实验步骤,这样方便大家帮你分析,有时一个实验细节决定了试验的成败。
8楼2013-02-22 21:08:52
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chuxuan

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-02-22 21:08:52
你最好有个详细的实验步骤,这样方便大家帮你分析,有时一个实验细节决定了试验的成败。...

我做接合的时候,步骤差不多是这样的
1、两菌养到对数期
2、各取3ML到EP管,离心
3、用LB洗两次
4、洗完之后就用LB悬浮
5、供体菌与受体菌差不多1:1进行混合
6、涂布到LB平板预培养6个小时
7、培养完之后,再将平板上长得菌用LB洗下来,涂布到菌特定的培养平板上。。这样就完了。。。。
9楼2013-02-22 21:14:23
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by chuxuan at 2013-02-22 21:14:23
我做接合的时候,步骤差不多是这样的
1、两菌养到对数期
2、各取3ML到EP管,离心
3、用LB洗两次
4、洗完之后就用LB悬浮
5、供体菌与受体菌差不多1:1进行混合
6、涂布到LB平板预培养6个小时
7、培养完之后, ...

不是标准的链霉菌接合转移方法,如果是链霉菌,建议参考PCR targeting protocol.
10楼2013-02-22 23:19:48
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