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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 挽救一个被错误操作的乙醇沉淀实验
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dorecnu

木虫 (正式写手)

[求助] 挽救一个被错误操作的乙醇沉淀实验

背景：双酶切后准备酚氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩DNA.
           样品比较珍贵不能重新制备样品。
错误：忘记了氯仿抽提步骤，在DNA溶液中加入了乙酸钠。
问题：1.加入乙酸钠后是否可重复酚氯仿抽提步骤？
          2.如不能，将错就错，继续乙醇沉淀。大量的蛋白也会被沉淀下来，会不会影响下一步DNA电泳。（制备的DNA准备用于southernblot 实验）

自己想的解决办法：
          1.将已加入乙酸的DNA溶液继续酚氯仿抽提，后乙醇沉淀。
这个方案的风险在于，高盐浓度下酚氯仿抽提会不会DNA也随之被抽走。因为我发现乙酸钠是可以溶解于酚氯仿溶液中的。
           2.将错就错的继续乙醇沉淀后，将乙醇、蛋白沉淀重新溶解于水中。重复酚氯仿抽提乙醇沉淀步骤，重新浓缩DNA。
该方案的风险在于反复沉淀可能造成DNA的大量损失。

请问各位木虫，有没有遇到相似的问题？能否支点招？
在线等！
谢谢大家。

[ Last edited by dorecnu on 2013-1-28 at 16:35 ]
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1楼 2013-01-28 16:36:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dorecnu: 金币+1, ★有帮助, 谢谢回复。我试过了，高盐浓度下dna回收率会降低60%以上；另外乙酸钠是可以溶解在酚氯仿中的，置于和水的分配比例不知道。比较好的解决方案是使用PCR片段回收试剂盒除盐，除蛋白后再用乙醇沉底浓缩一次。 2013-01-29 20:47:48
dorecnu: 金币+1, ★有帮助 2013-01-29 21:30:46
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-01-29 21:49:50
我认为你直接用酚氯仿抽蛋白是没有问题的。DNA是不溶于有机相的，盐好像应该在水相里吧，加了盐DNA也是在水相里，用乙醇或者异丙醇才会沉淀。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-01-29 01:31:04
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bubble1220

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dorecnu: 金币+2, ★★★很有帮助, 抽提是为了除去体系中的蛋白。乙醇沉淀对dna的回收没有偏好，大片段，小片段都可以得到很好的回收，回收效率我觉得会比试剂盒高。试剂盒的问题是有回收片段的偏好性，效率因试剂盒厂家不同波动较大，另外洗脱体积往往较大；优点是除盐，除蛋白比较彻底，我尝试使用天根Pcr片段纯化试剂盒除去体系中盐，再乙醇沉淀获得了较好的效果。因为试剂盒往往在高盐 低ph值时吸附dna，在低盐高ph值时洗脱。 2013-01-29 20:54:28
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-01-29 21:50:08
如果你的样品能够双酶切，说明样品很纯了已经，为什么还要抽提？
而且珍贵的样品乙醇沉淀会损失很多
建议酶切完毕后直接上PCR产物回收试剂盒，最后用水elution
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3楼2013-01-29 08:47:37
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