| 查看: 731 | 回复: 2 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
dorecnu木虫 (正式写手)
|
[求助]
挽救一个被错误操作的乙醇沉淀实验
|
||
|
背景：双酶切后准备酚氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩DNA. 样品比较珍贵不能重新制备样品。 错误：忘记了氯仿抽提步骤，在DNA溶液中加入了乙酸钠。 问题：1.加入乙酸钠后是否可重复酚氯仿抽提步骤？ 2.如不能，将错就错，继续乙醇沉淀。大量的蛋白也会被沉淀下来，会不会影响下一步DNA电泳。（制备的DNA准备用于southernblot 实验） 自己想的解决办法： 1.将已加入乙酸的DNA溶液继续酚氯仿抽提，后乙醇沉淀。 这个方案的风险在于，高盐浓度下酚氯仿抽提会不会DNA也随之被抽走。因为我发现乙酸钠是可以溶解于酚氯仿溶液中的。 2.将错就错的继续乙醇沉淀后，将乙醇、蛋白沉淀重新溶解于水中。重复酚氯仿抽提乙醇沉淀步骤，重新浓缩DNA。 该方案的风险在于反复沉淀可能造成DNA的大量损失。 请问各位木虫，有没有遇到相似的问题？能否支点招？ 在线等！ 谢谢大家。 [ Last edited by dorecnu on 2013-1-28 at 16:35 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 PCR问题集锦 |
» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有235人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 无水乙醇沉淀DNA
已经有14人回复
- 各位加A尾后还做胶回收或者乙醇沉淀麽？还是直接连接载体.
已经有14人回复
- 【交流】多糖水提醇沉 70%乙醇沉24h 室温 沉淀量不多 效果不好
已经有20人回复
- 怎样用无水乙醇和去离子水洗涤沉淀？
已经有23人回复
- 用乙醇沉淀多糖或蛋白时加入盐的浓度
已经有3人回复
- 我想浓缩质粒DNA，能用乙醇沉淀法吗？
已经有19人回复
- 谁做过乙醇沉淀法浓缩DNA呀？离心之后能用肉眼看到DNA吗？
已经有24人回复
- 求助本可以溶于水与乙醇的物质用丙酮沉淀提纯后不溶的原因
已经有7人回复
- 乙醇沉淀DNA的原始文献
已经有5人回复
- 分级沉淀 乙醇 多糖
已经有12人回复
- 求助：关于辅料在HPLC中杂质峰很多，干扰多
已经有4人回复
- 关于糖原、乙酸钠、乙醇沉淀核酸的问题
已经有5人回复
- 乙醇沉淀多糖的同时会将单糖也沉淀出来吗？
已经有7人回复
- DNA的酚氯仿抽提后乙醇沉淀不出来
已经有10人回复
- 用乙醇重结晶产生絮状沉淀，黏在瓶壁上的沉淀曾凝胶状，产生这种现象的原因？
已经有7人回复
- 【求助/交流】乙醇沉淀法纯化cDNA
已经有4人回复
- 【求助】酯的水解，乙醇和水的量各自是多少合适呀？酸化后怎么操作才能最佳的沉淀出来
已经有9人回复
- 【求助】聚合物用甲醇还是乙醇沉淀？
已经有20人回复
- 【交流】多糖沉淀后，用95%乙醇和无水乙醇洗涤的目的什么？
已经有44人回复
bubble1220
银虫 (小有名气)
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 683.9
- 红花: 1
- 帖子: 129
- 在线: 61.9小时
- 虫号: 1379298
- 注册: 2011-08-25
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dorecnu: 金币+2, ★★★很有帮助, 抽提是为了除去体系中的蛋白。乙醇沉淀对dna的回收没有偏好，大片段，小片段都可以得到很好的回收，回收效率我觉得会比试剂盒高。试剂盒的问题是有回收片段的偏好性，效率因试剂盒厂家不同波动较大，另外洗脱体积往往较大；优点是除盐，除蛋白比较彻底，我尝试使用天根Pcr片段纯化试剂盒除去体系中盐，再乙醇沉淀获得了较好的效果。因为试剂盒往往在高盐 低ph值时吸附dna，在低盐高ph值时洗脱。 2013-01-29 20:54:28
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-01-29 21:50:08
感谢参与，应助指数 +1
dorecnu: 金币+2, ★★★很有帮助, 抽提是为了除去体系中的蛋白。乙醇沉淀对dna的回收没有偏好，大片段，小片段都可以得到很好的回收，回收效率我觉得会比试剂盒高。试剂盒的问题是有回收片段的偏好性，效率因试剂盒厂家不同波动较大，另外洗脱体积往往较大；优点是除盐，除蛋白比较彻底，我尝试使用天根Pcr片段纯化试剂盒除去体系中盐，再乙醇沉淀获得了较好的效果。因为试剂盒往往在高盐 低ph值时吸附dna，在低盐高ph值时洗脱。 2013-01-29 20:54:28
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-01-29 21:50:08
|
如果你的样品能够双酶切，说明样品很纯了已经，为什么还要抽提？ 而且珍贵的样品乙醇沉淀会损失很多 建议酶切完毕后直接上PCR产物回收试剂盒，最后用水elution |
3楼2013-01-29 08:47:37
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dorecnu: 金币+1, ★有帮助, 谢谢回复。我试过了，高盐浓度下dna回收率会降低60%以上；另外乙酸钠是可以溶解在酚氯仿中的，置于和水的分配比例不知道。比较好的解决方案是使用PCR片段回收试剂盒除盐，除蛋白后再用乙醇沉底浓缩一次。 2013-01-29 20:47:48
dorecnu: 金币+1, ★有帮助 2013-01-29 21:30:46
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-01-29 21:49:50
感谢参与，应助指数 +1
dorecnu: 金币+1, ★有帮助, 谢谢回复。我试过了，高盐浓度下dna回收率会降低60%以上；另外乙酸钠是可以溶解在酚氯仿中的，置于和水的分配比例不知道。比较好的解决方案是使用PCR片段回收试剂盒除盐，除蛋白后再用乙醇沉底浓缩一次。 2013-01-29 20:47:48
dorecnu: 金币+1, ★有帮助 2013-01-29 21:30:46
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-01-29 21:49:50
| 我认为你直接用酚氯仿抽蛋白是没有问题的。DNA是不溶于有机相的，盐好像应该在水相里吧，加了盐DNA也是在水相里，用乙醇或者异丙醇才会沉淀。 |
2楼2013-01-29 01:31:04
