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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆筛选时 有关卡那霉素抗性菌落鉴定的一个问题
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ben7737873

铁虫 (初入文坛)

[求助] 克隆筛选时 有关卡那霉素抗性菌落鉴定的一个问题

如题，本人第一次做卡那霉素抗性的克隆筛选实验，昨天下午5点多开始培养的细菌，今早发现卡那平板上长了10来颗个体很大的菌落，和我以前做的氨苄板的菌落明显不同，只有1个菌落是正常大小的，请问是不是卡那霉素实验的培养时间不能这么长，要比氨苄板时间短些？或者说我的这些大个体菌落，都是杂菌？因为我听说环境中带有卡那的菌比氨苄多很多，是这样吗？谢谢
实验载体是重组的pet28a
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1楼 2013-01-08 09:43:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-08 20:52:16
ben7737873: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2013-01-14 17:27:42
没有这个说法，克隆大小和实验有关。即使同时转化相同的受体，用同样的抗性筛也有的板克隆大有的小。你说的个体大是多大？直径多少？你是否做了负对照？如果负对照不长的话应该不是杂菌。
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2楼2013-01-08 13:26:46
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ben7737873

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-08 13:26:46
没有这个说法，克隆大小和实验有关。即使同时转化相同的受体，用同样的抗性筛也有的板克隆大有的小。你说的个体大是多大？直径多少？你是否做了负对照？如果负对照不长的话应该不是杂菌。

直径大的感觉上都快接近2毫米了，平常我的菌落基本不会大于1毫米吧。负对照是用氨苄抗性的载体转化涂板吗？我没有做呢。。。如果负对照长说明我的卡那有问题，或者说我操作环境有问题咯？
下午摇了菌了，在LB KANA+的液体中，几个菌落大的，都摇出来了，现在正在PCR，反而那个个体正常的，好像挺清澈的，再放里面摇会，谢谢你了
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3楼2013-01-08 16:04:07
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
长时间太久了，就挑大的，就是有抗性的。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2013-01-08 20:19:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by ben7737873 at 2013-01-08 16:04:07
直径大的感觉上都快接近2毫米了，平常我的菌落基本不会大于1毫米吧。负对照是用氨苄抗性的载体转化涂板吗？我没有做呢。。。如果负对照长说明我的卡那有问题，或者说我操作环境有问题咯？
下午摇了菌了，在LB KAN ...

负对照是转化时不加DNA，其它处理和样品一样，涂相同的筛选板（你的是卡那）。这个一般是要做的吧，至少确定感受态和板没问题。如果液体摇菌时间太长还很稀的话可能有问题的。你可以直接做菌落PCR，鉴定为阳性后再摇菌提质粒鉴定比较好。
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5楼2013-01-09 08:03:58
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功夫熊猫1223

新虫 (初入文坛)
各位大侠好
我也是第一次用kana做筛选试验，我的质粒是lana，宿主菌是DH5.我遇到的问题很怪的：1.加有kana的液体培养基中经过摇菌长出细菌了，但是在加有kana的固体培养基分区划线后却长不出细菌，2.更奇怪的是培养基的底层还有类似气泡的小东西，刚开始还以为是菌落，最后看好像是培养基凹进去。3.我从长菌的液体培养基中取出一环分区划线，可是线上出现了很多液体，不一会时间，又在底层出现气泡似的东西。
我已经重复做了两次，培养基也是重新做的。为什么还是不行？
还有，我用的kana是硫酸卡那霉素，会有影响吗？终浓度用的50ug/ml.
各位大哥大姐，帮帮忙了，我快愁死了。谢谢谢谢！
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6楼2013-05-13 22:38:46
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吉祥jqz

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-08 13:26:46
没有这个说法，克隆大小和实验有关。即使同时转化相同的受体，用同样的抗性筛也有的板克隆大有的小。你说的个体大是多大？直径多少？你是否做了负对照？如果负对照不长的话应该不是杂菌。

大侠你好，我在做kan抗性筛选的时候，平板老是不长菌落是怎么回事？
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7楼2013-11-22 09:23:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 吉祥jqz at 2013-11-22 09:23:39
大侠你好，我在做kan抗性筛选的时候，平板老是不长菌落是怎么回事？...

卡那霉素筛选菌很好的。不清楚为什么你的板子不长。本身带卡那抗性的菌划线没问题吧。你可以先检查一下抗生素药品和配置是否有问题。转化时用卡那抗性的质粒做正对照。祝实验顺利。
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8楼2013-11-22 11:03:13
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