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sdXP0927

新虫 (初入文坛)

[求助] 两个不同蛋白都挂不上ni柱


最近纯化蛋白,两个不同的蛋白,一个是His 标签的,一个是Trx标签的(也带有6个his),可是从SDS/PAGE上看,都没有挂上ni柱
而其他人用过我用的ni柱,都挺好用的
师兄说可能是蛋白把his包起来了所以挂不上……可是两个不同的蛋白,为什么都是这样的状况?除了师兄说的那种可能,还有哪些可能的原因?
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王家大成

木虫 (正式写手)

囧囧小虫

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励交流 2013-01-08 22:39:38
首先确定你插入基因的时候是正确的,也就是能够表达出后面的组氨酸尾巴;然后要确定的是它真的表达了;它表达后是否降解了。
一念起,万水千山;一念灭,沧海桑田!
2楼2013-01-08 16:40:50
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sdXP0927

新虫 (初入文坛)


zhang8826857: 金币+1, 鼓励交流 2013-01-08 22:39:45
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王家大成 at 2013-01-08 16:40:50
首先确定你插入基因的时候是正确的,也就是能够表达出后面的组氨酸尾巴;然后要确定的是它真的表达了;它表达后是否降解了。

基因是没错的,筛选后测过序了。跑胶时条带的位置也是对的,可是就是挂不上柱子,师兄也在怀疑可能不是我的目的蛋白……那个条带挺明显的,不过没有跑诱导前的样作对比
3楼2013-01-08 22:38:23
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sdXP0927

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 王家大成 at 2013-01-08 16:40:50
首先确定你插入基因的时候是正确的,也就是能够表达出后面的组氨酸尾巴;然后要确定的是它真的表达了;它表达后是否降解了。

对了,那个TRX标签的确实在洗脱液里看不到目的条带,但是在更小的位置上有两个紧挨着条带,师兄说可能是空载的TRX 标签蛋白,但明明测序是正确的,并且即使一个是标签蛋白,那另一条带是什么呢?
4楼2013-01-08 22:41:30
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极道始之魔

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这个我也想知道, 也遇到了同样的问题,别人也能挂上,我的挂不上,不知道是不是因为目的基因前面带有起始密码子的原因,基因从这里开始翻译,压根就没有脸上his标签,别人用的是pet-28a载体的挂上了,楼主用的生命载体
5楼2013-10-08 15:53:05
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