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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 紫外吸收 测蛋白含量的 标准曲线制作问题
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小子木雨

铜虫 (小有名气)

[求助] 紫外吸收 测蛋白含量的 标准曲线制作问题

我用牛血清蛋白用0.9%的氯化钠配成到1mg/ml浓度，然后按下表
牛血清蛋白溶液（ml)        蒸馏水（ml)
0                                      4
0.5                                      3.5
1                                      3
1.5                                      2.5
2                                      2
2.5                                      1.5
3                                      1
3.5                                      0.5
4                                      0
加入试管中，以第一个管为参比，测定280nm下的吸光值，为什么出现的值都是0.2% ，Abs是2.776、2.755、2.785呢?希望尽快得到您的解答，谢谢
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1楼 2013-01-04 16:54:27
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tpFlexin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-01-05 18:57:39
方法看上去没错啊，是不是你错用了玻璃比色皿？
我能想到的只有这个了，玻璃比色皿在紫外区有吸收
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2楼2013-01-05 16:58:46
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hqsinberg

木虫 (著名写手)

清风小木虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+5, good! 2013-01-05 20:10:51
小子木雨: 金币+3, ★★★很有帮助, 我用的不是考马斯法 我用的是紫外吸收法，而且今天我又稀释了一下，测出的结果还是在2.几，很是郁闷呢 2013-01-08 20:33:49
估计不错的话，你应该是用的brandford法测定蛋白（也就是场所的考马斯亮蓝G250法）。我感觉你的初始牛血清蛋白浓度偏高，我们一般配0.1mg/ml,然后稀释不同倍数（类似你的操作，溶液体系一样大）。我们的经验是10-90ug/ml线性比较好，你的浓度太高了，超出了量程，自然就不是线性了。还有就是brandford法要求玻璃比色皿，浓度从低往高测定，测完后要清洗干净（乙醇浸泡，蒸馏水冲洗，测定液润洗0），再测下一个。一般相关系数都能到0.985左右。
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3楼2013-01-05 19:04:15
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hqsinberg

木虫 (著名写手)

清风小木虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by hqsinberg at 2013-01-05 19:04:15
估计不错的话，你应该是用的brandford法测定蛋白（也就是场所的考马斯亮蓝G250法）。我感觉你的初始牛血清蛋白浓度偏高，我们一般配0.1mg/ml,然后稀释不同倍数（类似你的操作，溶液体系一样大）。我们的经验是10-90 ...

再就是考马斯亮蓝法不能用石英比色皿，玻璃的即可。具体事宜可以参见http://www.doc88.com/p-78740359566.html，里面的做法比较准确
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4楼2013-01-05 19:10:03
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sherry0012

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。

在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
所以如果是这种方法，测定波长应该是595nm
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5楼2013-01-07 09:24:21
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小子木雨

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sherry0012 at 2013-01-07 09:24:21
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。

在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染 ...

谢谢啊 不过我用的是紫外吸收法测的蛋白含量 标准曲线是1mg/ml的牛血清蛋白，今天稀释了5倍还是2.7几的数值， 很郁闷，不知道问题出在了哪里
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6楼2013-01-08 20:36:47
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小子木雨

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tpFlexin at 2013-01-05 16:58:46
方法看上去没错啊，是不是你错用了玻璃比色皿？
我能想到的只有这个了，玻璃比色皿在紫外区有吸收

谢谢  我在280纳米处测的吸光值 应该没什么影响吧 就是不知道问题出在哪里
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7楼2013-01-08 20:39:17
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hqsinberg

木虫 (著名写手)

清风小木虫
引用回帖:
3楼: Originally posted by hqsinberg at 2013-01-05 19:04:15
估计不错的话，你应该是用的brandford法测定蛋白（也就是场所的考马斯亮蓝G250法）。我感觉你的初始牛血清蛋白浓度偏高，我们一般配0.1mg/ml,然后稀释不同倍数（类似你的操作，溶液体系一样大）。我们的经验是10-90 ...

如果拟采用260nm紫外吸收测定，必须采用石英比色皿
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8楼2013-11-18 20:53:49
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