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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于Pet28a载体构建的质粒，蛋白表达量低是怎么回事。请大家帮忙
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枫叶留殇

新虫 (正式写手)

[求助] 关于Pet28a载体构建的质粒，蛋白表达量低是怎么回事。请大家帮忙

以Pet28a为载体构建了两个蛋白的质粒，酶切位点是Nde1 和Sal 1，连接好的质粒分别送去测序，也都对着了。但是小量诱导表达时，其中一个表达量很低，有什么办法可以提高表达量呢？我的IPTG梯度分别是0.2mM ,0.4mM ,0.6mM．Marker左边和右边分别代表不同的蛋白。请大家指教。谢谢

SUMO1SUMO2小量诱导表达.png
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1楼2012-12-19 12:50:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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枫叶留殇: 金币+2 2012-12-20 18:25:24
你跑的全蛋白还是可溶蛋白？会不会令一个到包涵体里面去了？此外，不同蛋白的最优诱导条件（温度、时间、IPTG浓度）都不同。你可能需要摸索优化诱导条件。
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2楼2012-12-20 09:34:27
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westerli

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
密码子优化过了没？
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3楼2012-12-20 12:01:44
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枫叶留殇

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-20 09:34:27
你跑的全蛋白还是可溶蛋白？会不会令一个到包涵体里面去了？此外，不同蛋白的最优诱导条件（温度、时间、IPTG浓度）都不同。你可能需要摸索优化诱导条件。

那marker右边的有摸索条件的必要吗？需不需要换载体？图上的胶都是菌体，还没有破菌。只是看一下下是否能够表达而已。
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4楼2012-12-20 18:27:15
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枫叶留殇

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by westerli at 2012-12-20 12:01:44
密码子优化过了没？

实验室里之前的是GST 标签，但是挂柱子的效果不好，所以换到PET里了。和稀有密码字的影响不大吧？那如果有影响的话，该怎么优化呢？
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5楼2012-12-20 18:29:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 枫叶留殇 at 2012-12-20 18:27:15
那marker右边的有摸索条件的必要吗？需不需要换载体？图上的胶都是菌体，还没有破菌。只是看一下下是否能够表达而已。...

marker右边的那个只能说在你用诱导的条件下诱导不好，你可以试试增加IPTG浓度，延长诱导时间什么的。
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6楼2012-12-21 07:47:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 枫叶留殇 at 2012-12-20 18:29:19
实验室里之前的是GST 标签，但是挂柱子的效果不好，所以换到PET里了。和稀有密码字的影响不大吧？那如果有影响的话，该怎么优化呢？...

如果稀有密码子多的话需要优化碱基序列，替换掉稀有密码子。
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7楼2012-12-21 07:52:52
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ducktk

铜虫 (初入文坛)
你应该摸索一下表达条件，包括IPTG浓度，还有表达时间，摇菌时间，加IPTG的时间。右边那个表达量低的，你可以尝试在表达几个小时之后补加IPTG. 祝你成功！
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8楼2012-12-23 10:39:24
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枫叶留殇

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ducktk at 2012-12-23 10:39:24
你应该摸索一下表达条件，包括IPTG浓度，还有表达时间，摇菌时间，加IPTG的时间。右边那个表达量低的，你可以尝试在表达几个小时之后补加IPTG. 祝你成功！

好的，谢谢
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9楼2012-12-26 09:39:29
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