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zhangyonghu

木虫 (小有名气)

[求助] AFLP的欲扩范围大

我最近做AFLP,DNA里含点蛋白质,用PSTI和MSEI双酶切,可是欲扩以后在750那有一条亮带,弥散的范围也偏大,是怎么回事
是不是蛋白质对酶切存在影响,怎么能把蛋白质除掉呢
这是我的欲扩的图

未命名.jpg
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liugs

禁虫 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

2楼2012-11-26 06:42:21
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shucanwei

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
先把核酸质量搞上去先。核酸的OD值是多少?0  去蛋白的方法有多种:用蛋白酶K;用酚抽提;用试剂盒抽提。第三种最方便且毒性小。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
唯以一人治天下,不以天下奉一人。
3楼2012-11-26 07:25:36
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shucanwei

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你是提植物的吗?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
唯以一人治天下,不以天下奉一人。
4楼2012-11-26 07:26:40
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by shucanwei at 2012-11-26 07:25:36
先把核酸质量搞上去先。核酸的OD值是多少?0  去蛋白的方法有多种:用蛋白酶K;用酚抽提;用试剂盒抽提。第三种最方便且毒性小。

OD我们这测不了,用蛋白酶K都后续的没切影响大不?、
5楼2012-11-26 09:43:57
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by shucanwei at 2012-11-26 07:26:40
你是提植物的吗?

嗯,向日葵的
6楼2012-11-26 09:44:22
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CXL19880406

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+4, 鼓励应助 2012-11-26 18:52:25
首先,DNA里含蛋白是测的OD值发现的么?如果是用CTAB法的话有可能是酚没除净,但是如果做AFLP的话DNA的纯度是可以适当放低的,毕竟之后你要设计引物,PCR只按你的引物来扩增,蛋白影响不大的;其次,不知道你做的是什么DNA,我做的水稻预扩弥散一片,完全是没有条带的,但是做了选扩以后,条带就特别清晰很漂亮,我的老师告诉我在预扩过程中没有条带都是正常的,正常操作来讲是不需要跑胶的,建议你可以接着往下做选扩试试。祝好运~
7楼2012-11-26 11:10:31
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by CXL19880406 at 2012-11-26 11:10:31
首先,DNA里含蛋白是测的OD值发现的么?如果是用CTAB法的话有可能是酚没除净,但是如果做AFLP的话DNA的纯度是可以适当放低的,毕竟之后你要设计引物,PCR只按你的引物来扩增,蛋白影响不大的;其次,不知道你做的是 ...

谢谢,你的回帖。我现在是觉得我的弥散片段的分子量偏大,选扩的时候不出带,不知道是怎么回事啊
8楼2012-11-26 14:27:45
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CXL19880406

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangyonghu at 2012-11-26 14:27:45
谢谢,你的回帖。我现在是觉得我的弥散片段的分子量偏大,选扩的时候不出带,不知道是怎么回事啊...

那需要检测一下你设计的引物的特异性了吧,弥散分子里偏大说明你PCR的时候片段大了,那应该是引物的问题了,根据酶切位点设计的接头引物和另一个引物通过vector检测一下特异性,另外PCR的退火温度可以适当调整一下。我做的时候也是一点点摸的条件来出结果的。祝你成功~
9楼2012-11-26 14:41:09
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by CXL19880406 at 2012-11-26 14:41:09
那需要检测一下你设计的引物的特异性了吧,弥散分子里偏大说明你PCR的时候片段大了,那应该是引物的问题了,根据酶切位点设计的接头引物和另一个引物通过vector检测一下特异性,另外PCR的退火温度可以适当调整一下 ...

谢谢,是退火温度太低了么?
10楼2012-12-03 18:26:39
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