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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » AFLP的欲扩范围大
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)

[求助] AFLP的欲扩范围大

我最近做AFLP，DNA里含点蛋白质，用PSTI和MSEI双酶切，可是欲扩以后在750那有一条亮带，弥散的范围也偏大，是怎么回事
是不是蛋白质对酶切存在影响，怎么能把蛋白质除掉呢
这是我的欲扩的图

未命名.jpg
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1楼 2012-11-25 21:37:49
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liugs

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
2楼2012-11-26 06:42:21
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shucanwei

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先把核酸质量搞上去先。核酸的OD值是多少？0  去蛋白的方法有多种：用蛋白酶K;用酚抽提;用试剂盒抽提。第三种最方便且毒性小。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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唯以一人治天下，不以天下奉一人。
3楼2012-11-26 07:25:36
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shucanwei

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你是提植物的吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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唯以一人治天下，不以天下奉一人。
4楼2012-11-26 07:26:40
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shucanwei at 2012-11-26 07:25:36
先把核酸质量搞上去先。核酸的OD值是多少？0  去蛋白的方法有多种：用蛋白酶K;用酚抽提;用试剂盒抽提。第三种最方便且毒性小。

OD我们这测不了，用蛋白酶K都后续的没切影响大不？、
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5楼2012-11-26 09:43:57
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shucanwei at 2012-11-26 07:26:40
你是提植物的吗？

嗯，向日葵的
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6楼2012-11-26 09:44:22
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CXL19880406

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+4, 鼓励应助 2012-11-26 18:52:25
首先，DNA里含蛋白是测的OD值发现的么？如果是用CTAB法的话有可能是酚没除净，但是如果做AFLP的话DNA的纯度是可以适当放低的，毕竟之后你要设计引物，PCR只按你的引物来扩增，蛋白影响不大的；其次，不知道你做的是什么DNA，我做的水稻预扩弥散一片，完全是没有条带的，但是做了选扩以后，条带就特别清晰很漂亮，我的老师告诉我在预扩过程中没有条带都是正常的，正常操作来讲是不需要跑胶的，建议你可以接着往下做选扩试试。祝好运～
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7楼2012-11-26 11:10:31
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by CXL19880406 at 2012-11-26 11:10:31
首先，DNA里含蛋白是测的OD值发现的么？如果是用CTAB法的话有可能是酚没除净，但是如果做AFLP的话DNA的纯度是可以适当放低的，毕竟之后你要设计引物，PCR只按你的引物来扩增，蛋白影响不大的；其次，不知道你做的是 ...

谢谢，你的回帖。我现在是觉得我的弥散片段的分子量偏大，选扩的时候不出带，不知道是怎么回事啊
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8楼2012-11-26 14:27:45
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CXL19880406

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangyonghu at 2012-11-26 14:27:45
谢谢，你的回帖。我现在是觉得我的弥散片段的分子量偏大，选扩的时候不出带，不知道是怎么回事啊...

那需要检测一下你设计的引物的特异性了吧，弥散分子里偏大说明你PCR的时候片段大了，那应该是引物的问题了，根据酶切位点设计的接头引物和另一个引物通过vector检测一下特异性，另外PCR的退火温度可以适当调整一下。我做的时候也是一点点摸的条件来出结果的。祝你成功～
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9楼2012-11-26 14:41:09
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by CXL19880406 at 2012-11-26 14:41:09
那需要检测一下你设计的引物的特异性了吧，弥散分子里偏大说明你PCR的时候片段大了，那应该是引物的问题了，根据酶切位点设计的接头引物和另一个引物通过vector检测一下特异性，另外PCR的退火温度可以适当调整一下 ...

谢谢，是退火温度太低了么？
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10楼2012-12-03 18:26:39
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