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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 摇的转化到大肠杆菌的质粒有沉淀
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yujiajia

铁虫 (初入文坛)

[求助] 摇的转化到大肠杆菌的质粒有沉淀

有没有人遇到过这种情况，过夜摇转化到大肠杆菌的阳性质粒，发现第二天早上试管底部有很多白色沉淀，沉淀边缘有颗粒，含Amp的液体lb液体清亮，这是什么原因啊？
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坚持
1楼 2012-11-17 16:48:10
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒没转化到受体菌里，有白色沉淀可能是被杀死的大肠杆菌
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2楼2012-11-17 17:03:58
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czdaeq

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-11-19 13:37:40
大肠电、化转化的复苏不是要1个小时就可以了吗？如果是温敏型得用低温培养，那2个小时也足够了呀，怎么要过夜呢？不过貌似我也遇到过复苏阶段，感受态沉降（若是菌体没有鞭毛，更容易沉降）了，再摇起来过个10min再涂布，结果还是长出来了（人品啊!）。
下次你再遇到，可以弃上清，取一半涂个无抗板看看，是不是长满板（说明活性还行），就知道是不是死菌了；
不过你还是先确认一下是不是一定得过夜？！
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3楼2012-11-17 17:36:25
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yyll1988

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
沉淀中大部分都应该是在转化过程中产生的死菌，一半3h就可以复苏了，为什么要那么长时间啊?
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4楼2012-11-17 20:59:29
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天空2011

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们实验室一般复苏1h，那么长时间肯定大部分是死菌！
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5楼2012-11-17 22:04:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
筛选平板上的Amp部分失效，克隆为假阳性，液体培养时抗生素不完全杀死或者抑制菌体生长，所以沉淀在底部。
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6楼2012-11-18 01:30:31
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yujiajia

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by czdaeq at 2012-11-17 17:36:25
大肠电、化转化的复苏不是要1个小时就可以了吗？如果是温敏型得用低温培养，那2个小时也足够了呀，怎么要过夜呢？不过貌似我也遇到过复苏阶段，感受态沉降（若是菌体没有鞭毛，更容易沉降）了，再摇起来过个10min再 ...

我这个不是做电转的，就是连到克隆载体上，再转化到大肠杆菌DH5a里的，后面的过夜培养是为了提取质粒
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坚持
7楼2012-11-19 23:51:02
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yujiajia

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xj0311 at 2012-11-17 17:03:58
质粒没转化到受体菌里，有白色沉淀可能是被杀死的大肠杆菌

我摇的是经过筛选的阳性菌，跑菌液pcr有目的条带的
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坚持
8楼2012-11-19 23:53:45
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yujiajia

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yyll1988 at 2012-11-17 20:59:29
沉淀中大部分都应该是在转化过程中产生的死菌，一半3h就可以复苏了，为什么要那么长时间啊?

我这个是摇的经过筛选的阳性质粒，第二天为了提质粒，因为后面还要做酶切
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坚持
9楼2012-11-19 23:55:47
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

氨苄板抗性失效或者菌液加的氨苄抗性浓度太大，最可能的原因是假阳性没转进去，建议重复做一下
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10楼2012-11-20 09:17:29
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