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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆一个未知基因，3‘端和5'端拿不完整怎么办？
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fengyunqb

新虫 (小有名气)

[交流] 克隆一个未知基因，3‘端和5'端拿不完整怎么办？

我是克隆一个未知的基因，首先拿到了大概1200BP的中间保守区，然后做3'  5'RACE，因为这个基因相近物种中还没有确切的公布，只有预测的，并且还长短不一，我也不知道3'端该有多长，5'端又该有多长。做RACE出现的条带有一大堆。我最终是想做表达看能不能表达的，这样子不用纠结3'端和5'端是不是走到头了对吗？因为这个基因CDS也就一千多点，编码的蛋白也就五百多个氨基酸。有谁能给我建议建议，谢谢。
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1楼 2012-11-14 09:58:09
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quintas

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
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fengyunqb: 金币+2 2012-11-14 11:30:31
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-14 16:42:13
可以考虑分成两段做RACE, 拼接的时候注意一下就可以了。
建议直接PCR, P不出来再RACE, 酶可以用高保真的。
NCBI查一查, 比对一下亲缘关系, 在保守区设计引物, 个人认为效果比RACE好。
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2楼2012-11-14 10:29:34
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by quintas at 2012-11-14 10:29:34
可以考虑分成两段做RACE, 拼接的时候注意一下就可以了。
建议直接PCR, P不出来再RACE, 酶可以用高保真的。
NCBI查一查, 比对一下亲缘关系, 在保守区设计引物, 个人认为效果比RACE好。

恩，是的，但是RACE就是PCR啊，先反转录，然后PCR，用特异性引物和接头引物，做曹氏PCR。我想能拿多少算多少吧，实验纠结 太完美累死了。谢谢帮忙。
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3楼2012-11-14 11:30:25
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31569218

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fengyunqb: 金币+1 2012-11-15 13:14:57
3‘端是否完整还是容易，至于5’端看有无你所用的街头引物就好了啊
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4楼2012-11-14 12:58:02
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quintas

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by fengyunqb at 2012-11-14 11:30:25
恩，是的，但是RACE就是PCR啊，先反转录，然后PCR，用特异性引物和接头引物，做曹氏PCR。我想能拿多少算多少吧，实验纠结 太完美累死了。谢谢帮忙。...

这里是指直接P完整的ORF拉~
客气
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5楼2012-11-14 15:53:42
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 31569218 at 2012-11-14 12:58:02
3‘端是否完整还是容易，至于5’端看有无你所用的街头引物就好了啊

就是出现的条带太多，又不知道具体3;端应该有多大，怕拿去测序的条带不是全部长。5‘还没做呢。谢谢帮忙。
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6楼2012-11-15 13:14:50
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qhuzhl

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fengyunqb: 金币+2 2012-11-18 15:24:02
5'端可以用软件分析下有没有TATA框，启动子及转录因子什么的，如果都有的话，肯定5‘RACE就可以了，个人感觉是这样的。
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8楼2012-11-16 15:56:29
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31569218

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fengyunqb: 金币+2 2012-11-18 15:26:19
引用回帖:
6楼: Originally posted by fengyunqb at 2012-11-15 13:14:50
就是出现的条带太多，又不知道具体3;端应该有多大，怕拿去测序的条带不是全部长。5‘还没做呢。谢谢帮忙。...

3'端有结尾信号啊。。。。。。。。。。。。
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10楼2012-11-18 09:59:13
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
内容已删除
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11楼2012-11-18 15:24:19
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 31569218 at 2012-11-18 09:59:13
3'端有结尾信号啊。。。。。。。。。。。。...

你说终止子吗？结尾信号是什么？谢谢。
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12楼2012-11-18 15:26:11
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qhuzhl

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fengyunqb: 金币+2 2012-11-20 11:43:37
引用回帖:
12楼: Originally posted by fengyunqb at 2012-11-18 15:26:11
你说终止子吗？结尾信号是什么？谢谢。...

就是加polyA的信号，一般是AATAAA吧。
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13楼2012-11-18 18:11:39
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天蛇2012

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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fengyunqb: 金币+2 2012-11-20 11:43:55
用RACE做应该没问题，扩完进行ＴＡ克隆，测序看看
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14楼2012-11-20 10:54:22
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 天蛇2012 at 2012-11-20 10:54:22
用RACE做应该没问题，扩完进行ＴＡ克隆，测序看看

谢谢。
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15楼2012-11-20 11:43:50
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
内容已删除
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16楼2012-12-24 09:10:01
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qhuzhl

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by fengyunqb at 2012-12-24 09:10:01
3'端测序结果出来以后，发现了在距离末端100多bp位置有AATAAA结构。这样算POLY A吗，但是没有找到试剂盒的引物。末端应该出现试剂盒的引物的。有什么软件推荐分析3'端的吗。...

你的polyA有多长，如果太长了的话，后面的引物测出来肯定就不准了，所以，找不到试剂盒的引物也是对的。
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17楼2012-12-24 14:25:32
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by qhuzhl at 2012-12-24 14:25:32
你的polyA有多长，如果太长了的话，后面的引物测出来肯定就不准了，所以，找不到试剂盒的引物也是对的。...

谢谢，你是说AATAAA结构后面连续的A或者T碱基吗，不长，只有十个。测序部说法是后面信号不好，还有几十bp没测出来，我是想着如果能找到结尾信号就无需再做TA克隆再去测了，省得麻烦。但是也没依据来确定是否结尾。
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18楼2012-12-24 15:05:11
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qhuzhl

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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fengyunqb: 金币+2 2012-12-25 10:56:21
引用回帖:
18楼: Originally posted by fengyunqb at 2012-12-24 15:05:11
谢谢，你是说AATAAA结构后面连续的A或者T碱基吗，不长，只有十个。测序部说法是后面信号不好，还有几十bp没测出来，我是想着如果能找到结尾信号就无需再做TA克隆再去测了，省得麻烦。但是也没依据来确定是否结尾。...

连续的A不一定是紧跟着AATAAA后面，也可能是间隔了几到十几个碱基。
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fengyunqb
19楼2012-12-24 18:22:19
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
19楼: Originally posted by qhuzhl at 2012-12-24 18:22:19
连续的A不一定是紧跟着AATAAA后面，也可能是间隔了几到十几个碱基。...

下面是我的序列结尾，我觉得是不是不能单纯看终止密码子和POLY A 的综合同源基因来分析，还有3'端即使没有到头对后来的全基因表达和递交序列到NCBI应该没什么影响吧。ATTGCAAATGTTTCATGCCAATAAATATTTATTGTTTGAGCACAAAAAAAAA
感谢你的帮助。
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20楼2012-12-25 10:56:11
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qhuzhl

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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fengyunqb: 金币+2 2012-12-25 17:01:39
引用回帖:
20楼: Originally posted by fengyunqb at 2012-12-25 10:56:11
下面是我的序列结尾，我觉得是不是不能单纯看终止密码子和POLY A 的综合同源基因来分析，还有3'端即使没有到头对后来的全基因表达和递交序列到NCBI应该没什么影响吧。ATTGCAAATGTTTCATGCCAATAAATATTTATTGTTTGAGCAC ...

提交序列应该没什么影响，表达的话应该都不用管终止密码后面的东西吧，一般真核表达载体上都有载体附带的加尾信号，原核表达只是看你要表达的部分就行了。以下是我测序的片段AATAAATATTGGCTTAAATGTCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，AATAAA距离终止密码有十几-一百几十个核苷酸不等。
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21楼2012-12-25 15:55:27
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by qhuzhl at 2012-12-25 15:55:27
提交序列应该没什么影响，表达的话应该都不用管终止密码后面的东西吧，一般真核表达载体上都有载体附带的加尾信号，原核表达只是看你要表达的部分就行了。以下是我测序的片段AATAAATATTGGCTTAAATGTCGAAAAAAAAAAAAA ...

暂且放下，接着做5'RACE，做完不成再补吧。谢谢帮助。
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22楼2012-12-25 17:02:45
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cute_man

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果做原核表达，拿到cds就可以分析ORF做表达了，要拿基因组序列，如果有基因组数据就简单了，直接往上比就能找到了
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23楼2013-05-08 10:02:10
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swxyk017楼
2012-11-15 13:34   回复  
樱木花道69楼
2012-11-16 17:06   回复  
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