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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆一个未知基因，3‘端和5'端拿不完整怎么办？
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fengyunqb

新虫 (小有名气)

[交流] 克隆一个未知基因，3‘端和5'端拿不完整怎么办？

我是克隆一个未知的基因，首先拿到了大概1200BP的中间保守区，然后做3'  5'RACE，因为这个基因相近物种中还没有确切的公布，只有预测的，并且还长短不一，我也不知道3'端该有多长，5'端又该有多长。做RACE出现的条带有一大堆。我最终是想做表达看能不能表达的，这样子不用纠结3'端和5'端是不是走到头了对吗？因为这个基因CDS也就一千多点，编码的蛋白也就五百多个氨基酸。有谁能给我建议建议，谢谢。
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1楼 2012-11-14 09:58:09
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by qhuzhl at 2012-12-24 14:25:32
你的polyA有多长，如果太长了的话，后面的引物测出来肯定就不准了，所以，找不到试剂盒的引物也是对的。...

谢谢，你是说AATAAA结构后面连续的A或者T碱基吗，不长，只有十个。测序部说法是后面信号不好，还有几十bp没测出来，我是想着如果能找到结尾信号就无需再做TA克隆再去测了，省得麻烦。但是也没依据来确定是否结尾。
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18楼2012-12-24 15:05:11
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quintas

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fengyunqb: 金币+2 2012-11-14 11:30:31
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-14 16:42:13
可以考虑分成两段做RACE, 拼接的时候注意一下就可以了。
建议直接PCR, P不出来再RACE, 酶可以用高保真的。
NCBI查一查, 比对一下亲缘关系, 在保守区设计引物, 个人认为效果比RACE好。
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2楼2012-11-14 10:29:34
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by quintas at 2012-11-14 10:29:34
可以考虑分成两段做RACE, 拼接的时候注意一下就可以了。
建议直接PCR, P不出来再RACE, 酶可以用高保真的。
NCBI查一查, 比对一下亲缘关系, 在保守区设计引物, 个人认为效果比RACE好。

恩，是的，但是RACE就是PCR啊，先反转录，然后PCR，用特异性引物和接头引物，做曹氏PCR。我想能拿多少算多少吧，实验纠结 太完美累死了。谢谢帮忙。
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3楼2012-11-14 11:30:25
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31569218

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fengyunqb: 金币+1 2012-11-15 13:14:57
3‘端是否完整还是容易，至于5’端看有无你所用的街头引物就好了啊
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4楼2012-11-14 12:58:02
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