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tulip1213

银虫 (小有名气)

[求助] PCR退火时间选择

最近做菌液PCR,鉴定克隆;之前我退火时间总是选择在30秒,今天用了1min,结果引物二聚体很亮,连非特异性条带都没有。
退火时间30秒还是一分钟合适?
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448935271

银虫 (小有名气)

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我用的是半分钟的
万物皆有毒,只要剂量足
2楼2012-11-09 16:14:23
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普通回帖

金丝铁线

新虫 (初入文坛)

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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-11-10 15:34:08
引物二聚体很亮,你应该多考虑其他因素,引物本身,pcr结束后是否在室温放置太长时间,引物量过大 or 模板浓度过小等,也可以取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的,也有人通过95°预变性5分钟据说效果也可以。。。你说的那个延长退火时间,我也看到过类似的说法,能减少二聚体。。没试过,但我觉得毕竟不是主要原因把,把其他方面做好,应该就没问题啦
3楼2012-11-09 16:44:49
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天空2011

铜虫 (小有名气)

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退火时间是与引物的长度有关的,因此,一般30s就足够了。
4楼2012-11-09 16:56:14
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ziwen120717

木虫 (初入文坛)

个人觉得,楼主把目光放在为什么没有特异性条带上比较好。
不想写了
5楼2012-11-09 16:59:37
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愤怒的小笨鸟

木虫 (正式写手)

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我也是用30s,没问题的
6楼2012-11-09 21:35:06
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duzhichao

木虫 (小有名气)

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大部分都是30s,时间长了,会特异性的扩增。
天道酬勤!
7楼2012-11-10 00:28:52
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tulip1213

银虫 (小有名气)

谢谢各位回帖,重新做了一次,没有条带,继续做克隆吧
8楼2012-11-10 17:17:13
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sc5921041

木虫 (著名写手)

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30s usually  and the temperature is about 55-64
nostalgia
9楼2012-11-11 00:17:18
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liuan6126

铁杆木虫 (正式写手)

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时间只是跟片段大小有关,建议提高退火温度。
10楼2012-11-11 11:09:33
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