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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR退火时间选择
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tulip1213

银虫 (小有名气)

[求助] PCR退火时间选择

最近做菌液PCR，鉴定克隆；之前我退火时间总是选择在30秒，今天用了1min，结果引物二聚体很亮，连非特异性条带都没有。
退火时间30秒还是一分钟合适？
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1楼 2012-11-09 15:40:46
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

448935271

银虫 (小有名气)

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我用的是半分钟的
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万物皆有毒，只要剂量足
2楼2012-11-09 16:14:23
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金丝铁线

新虫 (初入文坛)

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★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-11-10 15:34:08
引物二聚体很亮，你应该多考虑其他因素，引物本身，pcr结束后是否在室温放置太长时间，引物量过大 or 模板浓度过小等，也可以取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的，也有人通过95°预变性5分钟据说效果也可以。。。你说的那个延长退火时间，我也看到过类似的说法，能减少二聚体。。没试过，但我觉得毕竟不是主要原因把，把其他方面做好，应该就没问题啦
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3楼2012-11-09 16:44:49
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天空2011

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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退火时间是与引物的长度有关的，因此，一般30s就足够了。
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4楼2012-11-09 16:56:14
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ziwen120717

木虫 (初入文坛)
个人觉得，楼主把目光放在为什么没有特异性条带上比较好。
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不想写了
5楼2012-11-09 16:59:37
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愤怒的小笨鸟

木虫 (正式写手)

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我也是用30s，没问题的
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6楼2012-11-09 21:35:06
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duzhichao

木虫 (小有名气)

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大部分都是30s，时间长了，会特异性的扩增。
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天道酬勤！
7楼2012-11-10 00:28:52
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tulip1213

银虫 (小有名气)
谢谢各位回帖，重新做了一次，没有条带，继续做克隆吧
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8楼2012-11-10 17:17:13
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sc5921041

木虫 (著名写手)

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30s usually  and the temperature is about 55-64
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nostalgia
9楼2012-11-11 00:17:18
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liuan6126

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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时间只是跟片段大小有关，建议提高退火温度。
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10楼2012-11-11 11:09:33
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