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tulip1213

银虫 (小有名气)

[求助] PCR退火时间选择

最近做菌液PCR,鉴定克隆;之前我退火时间总是选择在30秒,今天用了1min,结果引物二聚体很亮,连非特异性条带都没有。
退火时间30秒还是一分钟合适?
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愤怒的小笨鸟

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我也是用30s,没问题的
6楼2012-11-09 21:35:06
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448935271

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我用的是半分钟的
万物皆有毒,只要剂量足
2楼2012-11-09 16:14:23
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金丝铁线

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-11-10 15:34:08
引物二聚体很亮,你应该多考虑其他因素,引物本身,pcr结束后是否在室温放置太长时间,引物量过大 or 模板浓度过小等,也可以取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的,也有人通过95°预变性5分钟据说效果也可以。。。你说的那个延长退火时间,我也看到过类似的说法,能减少二聚体。。没试过,但我觉得毕竟不是主要原因把,把其他方面做好,应该就没问题啦
3楼2012-11-09 16:44:49
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天空2011

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
退火时间是与引物的长度有关的,因此,一般30s就足够了。
4楼2012-11-09 16:56:14
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