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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细胞凋亡实验，请教消化问题，欢迎大家前来指导
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2011加油

银虫 (正式写手)

[交流] 细胞凋亡实验，请教消化问题，欢迎大家前来指导

大家好，我最近头一回做了凋亡实验，可能是消化（不含EDTA胰酶）没有掌握好，导致溶剂对照组中出现较多的早期凋亡细胞（30%多的比例），收集前显微镜下观察该组细胞时，没有太多细胞出现脱落，从得到结果分析，有可能是消化过度了，造成假阳性结果。我铺板是6孔板，请问大家每孔加入多少胰酶，是否是看到细胞变圆未脱落前，就开始终止消化，这样的效果会较好吗？？？请战友们多多指导，求下回实验顺利！谢谢大家
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1楼 2012-11-01 09:27:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

简若

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你是什么细胞啊，我做的细胞一般加0.5ml，细胞开始大面积脱落时就立马终止，一般2-3min，和你实验室的温度也是有关系的！
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19楼2013-04-02 21:38:33
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普通回帖

jiangyinshen

木虫 (著名写手)
★ ★
2011加油(金币+1): 谢谢参与
2011加油: 金币+1, 谢谢交流，我只加了每孔0.5毫升，它都容易过度了哦 2012-11-01 11:30:15
六孔板加1ml胰酶足矣，消化不要超过5min，否则对细胞不好
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2楼2012-11-01 09:56:48
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piaoyingaza

木虫 (著名写手)
★ ★
2011加油(金币+1): 谢谢参与
2011加油: 金币+1, 谢谢顶贴，1毫升有可能还是多了哦 2012-11-01 11:30:42
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiangyinshen at 2012-11-01 09:56:48
六孔板加1ml胰酶足矣，消化不要超过5min，否则对细胞不好

受教了
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3楼2012-11-01 09:57:25
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piaoying_jys

木虫 (著名写手)
★ ★
2011加油(金币+1): 谢谢参与
2011加油: 金币+1, 谢谢顶贴 2012-11-01 11:30:58
都是高手啊
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4楼2012-11-01 09:57:55
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448935271

银虫 (小有名气)
★ ★
2011加油(金币+1): 谢谢参与
2011加油: 金币+1, 谢谢交流，你一般每孔加多少胰酶哦，请不吝赐教，急盼再回复，哈哈 2012-11-01 11:33:36
"细胞变圆未脱落前，就开始终止消化"这是必须的
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6楼2012-11-01 10:50:45
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IMJane

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这个得看你是什么细胞。每种细胞贴壁程度都不同，所以消化时间也不同。但是一般是3到5min。
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8楼2012-11-01 13:18:20
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448935271

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
每孔1ml的样子，具体根据你养的细胞情况做调整
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9楼2012-11-01 17:15:54
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 448935271 at 2012-11-01 17:15:54
每孔1ml的样子，具体根据你养的细胞情况做调整

谢谢啊
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10楼2012-11-01 18:55:20
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churchill87426

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们6孔板都是只加200ul胰酶。。。
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11楼2012-11-01 19:42:02
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by churchill87426 at 2012-11-01 19:42:02
我们6孔板都是只加200ul胰酶。。。

恩，确实加少一些更合适，我这回加了哦0.5毫升，它消化过度了哦。然后你是等到细胞变圆未脱落，就停止消化不？盼再回复，谢谢啊。
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12楼2012-11-01 21:39:14
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churchill87426

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
???????:
12?: Originally posted by 2011???? at 2012-11-01 21:39:14
???????????Щ????????????????0.5????????????????????????????????????δ????????????????????????лл????...

我等到细胞???圆，未脱???时就终止消化。
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13楼2012-11-02 08:11:21
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2011加油

银虫 (正式写手)
???????:
13?: Originally posted by churchill87426 at 2012-11-02 08:11:21
我等到细胞???圆，未脱???时就终止消化。...

?????????????
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14楼2012-11-02 08:16:38
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churchill87426

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by 2011加油 at 2012-11-02 08:16:38
是乱码，看不懂哦...

我们是等消化变圆了就终止消化的。
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15楼2012-11-02 08:33:04
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by churchill87426 at 2012-11-02 08:33:04
我们是等消化变圆了就终止消化的。...

好的，谢谢指导，我明白了。
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16楼2012-11-02 14:38:55
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hallen6891

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
早期凋亡应该用ANNEXIS IV检测的哈，除去消化问题不说，我想知道你做流式的时候，Gates是怎么圈定的，早期凋亡的话细胞膜完整度还是比较好的，但是还是会变小，皱缩，同时内部颗粒物质增多，复杂程度增加，也就是FSC变小，SSC变大哈。
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17楼2012-11-29 15:57:32
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2011加油

银虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by hallen6891 at 2012-11-29 15:57:32
早期凋亡应该用ANNEXIS IV检测的哈，除去消化问题不说，我想知道你做流式的时候，Gates是怎么圈定的，早期凋亡的话细胞膜完整度还是比较好的，但是还是会变小，皱缩，同时内部颗粒物质增多，复杂程度增加，也就是FS ...

我使用南京凯基的Annexin-v FITC和PI的凋亡试剂盒检测，我遇到的问题是，消化掌握的不是太好，可能造成假阳性出现，溶剂组和阴性对照组在显微镜下观察时，情况差不多，给药组的细胞出现细胞抑制挺明显的。但做出来的结果是，溶剂组的早期凋亡好高比例，有时甚至高过给药组中的最大剂量组，所以觉得自己操作不当。
我把阴性对照组（不加药）细胞分成三等分，划门时，我是用一个一份不加任何染料的阴性对照组先上机，再用另外两份单染的阴性对照组上机。
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18楼2012-11-29 16:08:26
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2011加油

银虫 (正式写手)
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19楼: Originally posted by 简若 at 2013-04-02 21:38:33
你是什么细胞啊，我做的细胞一般加0.5ml，细胞开始大面积脱落时就立马终止，一般2-3min，和你实验室的温度也是有关系的！

胶质瘤细胞和肺癌细胞哦  溶剂组的我始终没用处理得很好 导致假阳性结果
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20楼2013-04-06 10:17:33
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genuine147

新虫 (初入文坛)
★
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我正在纠结六孔板加胰酶的量，受教了，谢谢
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21楼2013-06-13 22:03:39
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genuine147

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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20楼: Originally posted by 2011加油 at 2013-04-06 10:17:33
胶质瘤细胞和肺癌细胞哦  溶剂组的我始终没用处理得很好 导致假阳性结果...

请问楼主，你做凋亡还做溶剂组？溶剂组是加什么的？我也打算做凋亡，还有很多事情不太明白，向你请教下。
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22楼2013-06-13 22:05:57
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jinhua0427

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12楼: Originally posted by 2011加油 at 2012-11-01 21:39:14
恩，确实加少一些更合适，我这回加了哦0.5毫升，它消化过度了哦。然后你是等到细胞变圆未脱落，就停止消化不？盼再回复，谢谢啊。...

细胞变圆未脱落就可以终止消化了的，太久会导致消化过度的。
你可以加EDTA啊，那样消化的应该会快一些。
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23楼2014-05-08 10:10:28
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jinhua0427

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
20楼: Originally posted by 2011加油 at 2013-04-06 10:17:33
胶质瘤细胞和肺癌细胞哦  溶剂组的我始终没用处理得很好 导致假阳性结果...

肺癌细胞是很容易消化的，A549，细胞生长较快，应该是有规律的，生长快的，容易消化。
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24楼2014-05-08 10:12:44
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dumbooo

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我认为首先要根据细胞而定，需要摸索细胞的特性，即使是贴壁细胞，也有贴壁性强弱之分，通常是消化至有少数细胞开始脱落便可终止消化然后进行吹打，6孔板的话，我认为500ul左右应该可以了，只要能覆盖细胞就够了，另外如果细胞本身状态不是很好，比如传了很多代以后，可能也容易效果不好，综合来讲，我认为主要还是摸清细胞特性。
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25楼2015-07-19 21:44:50
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mlanqiang5楼
2012-11-01 10:05   回复  
2011加油(金币+1): 谢谢参与
2011加油: 金币+1, 谢谢顶贴 2012-11-01 11:31:09
2011加油7楼
2012-11-01 11:34   回复  
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